文摘
背景:米勒费雪症候群(MFS)、格林-巴利综合征的一种变体,与神经肌肉阻断抗体的存在有关,其中一些可能针对神经节苷脂GQ1b。
材料与方法:作者调查的体外影响血清和纯化免疫球蛋白(Ig)共有11 G典型MFS在活动性疾病,患者在复苏后三个病人。从一个病人的血清,我们准备一个免疫球蛋白部分富含anti-GQ1b抗体亲和色谱法。对于联合预处理和突触后分析,终板电流被灌注记录macro-patch夹电极。突触后烟碱乙酰胆碱受体通道膜片钳技术进行了一个外部培养小鼠肌管。
结果:AllMFS-sera抑郁引发量子释放和减少突触后电流的振幅。另外五个的11个血清检查外部膜片箝分析,造成浓度和可逆acetylcholine-induced电流下降。激活的时间进程和烟碱乙酰胆碱受体的脱敏渠道没有被MFS-IgG改变。9例(82%)阳性anti-GQ1b抗体ELISA和点状。丰富anti-GQ1b抗体血清作为整体分数也有类似的效果。从MFS复苏后,阻塞活动最初丢失和血清阳性anti-GQ1b抗体变得消极。
结论:循环免疫球蛋白抗体诱导前和突触后封锁可能在急性MFS发挥致病作用。
米勒费雪症候群(MFS)特点是三合一的步态共济失调,外部眼肌麻痹,无反射。1格林-巴利综合征(GBS)的一个变种,MFS被认为是免疫病理学周围神经系统的紊乱。免疫球蛋白(Ig) G自身抗体针对神经节苷脂GQ1b在急性期血清MFS患者的90%以上。2 - 4⇓⇓神经节甘脂中存在高浓度在周围神经轴突和髓鞘,和一些研究表明,不同的神经节甘脂(例如,GM1)出席Ranvier和神经肌肉连接的节点。5远端运动神经终端缺乏2的障碍,使其接近进行循环抗体和一个合适的地点调查血清抗体的功能效应实验。
有证据表明,MFS血清块在鼠标偏侧膈神经肌肉传递。6 - 9⇓⇓⇓用细胞内微电极技术,显著提高自发释放(即。,米iniature endplate potential frequency) after application of MFS sera, followed by inexcitability of the muscle upon phrenic nerve stimulation has been demonstrated.6,9⇓在这项研究中,效果完全取决于补充的存在,9和微小终板电位(MEPP)振幅出现不变。6,9⇓灌注与macro-patch夹电极,我们曾表明,纯化免疫球蛋白分数和分数包含单价,antigen-binding(工厂)的碎片两个MFS快速、可逆抑郁患者诱发量子释放,而IgM分数没有影响。7、8⇓此外,MFS-IgG单量子的振幅降低,表明叠加突触后的效果。8
在目前的研究中,我们解决了突触后端直接通过检查MFS-IgG对乙酰胆碱的影响(Ach)全身的电流在小鼠肌管使用外部膜片箝分析。使用灌注macro-patch夹电极我们调查是否存在阻塞MFS患者抗体是一个更一般的特性,无论是疾病相关。
材料和方法。
病人血清和纯化免疫球蛋白。
十一MFS患者根据标准临床和电生理学的标准定义。10、11⇓六个男人和五个女人包括23岁和71岁之间。前一个病人胃肠道感染和六名病人有上呼吸道感染。五个病人(患者1、3、6、7、8)显示球参与除了眼肌麻痹,但没有广义肌肉无力。四个病人(病人2、4、9、10)提出了眼肌麻痹和温和的广义的弱点(1或2级休斯)。12两个病人(患者5和11)开发严重广义肌无力(休斯4到5年级)最初纯粹眼外参与。13在四个病人(患者5、6、7、8),复合肌肉动作电位振幅适度减少前后血清收集。六个病人接受血浆置换(患者1、4、5、9、10、11),和两个静脉注射免疫球蛋白治疗患者(7和8)。除了病人8人死于败血症,几乎所有的病人最终恢复正常或正常神经功能(7例在4周内恢复)。
早期血清样本获得后2周内出现症状。等离子体得到滤液在血浆置换联合治疗;膜片箝调查,滤液的第一选择(即交换。之前,任何额外的治疗)。恢复期的血清样本中获得三个病人完全康复后至少6个月后出现疾病。血清样本存储长达1周在4°C,然后−20°C到使用。免疫球蛋白被亲和色谱法纯化如前所述。7冻干免疫球蛋白溶解在分析缓冲只是之前使用。
为控制实验(控制免疫球蛋白),一个商业多克隆免疫球蛋白制剂(Venimmun Aventis-Behring,马尔堡,德国)使用。额外的控制从颈椎盘突出患者血清样本,和包柔氏螺旋体感染和polyradiculitis被外部膜片钳研究分析。
Anti-GQ1b部分纯化的抗体亲和色谱法从一个血清(病人11)。里面high-titer anti-GQ1b (1:3,200 ELISA和1:32,000覆盖高性能薄层色谱法(效果)),和边缘低滴度的anti-GD3(1/4,000叠加分离法和anti-GD1b叠加效果(1/500)。为了减少污染与其他免疫球蛋白和补充组件,纯化免疫球蛋白分数(Mab陷阱GII工具包,法玛西亚,瑞典)从这个病人的血清用于进一步亲和色谱法。Octyl-Sepharose 4 b(法玛西亚,瑞典)用作绑定凝胶纯化抗原GQ1b(σ化学公司,圣路易斯,密苏里州)所描述。14这种凝胶是洗几次1:1的甲醇/水的解决方案包含0.1氯化钾(方案1)和平衡相同的解决方案。部分纯化GQ1b(0.4毫克)溶解在1.6毫升溶液1和在70°C水浴加热30分钟。然后,1.5毫升凝胶与暂停GQ1b共轭和亲和色谱法用一个列。列是用磷酸盐(PBS) pH值7.4,和病人血清免疫球蛋白部分补充道。列与PBS再次清洗,去除游离抗体。解吸装置抗体绑定的凝胶,列在室温下是筛选了与3 M NaSCN洗出液收集在1毫升分数。然后,每个样本的平均吸光度在280 nm波长分光光度法。分数包含anti-GQ1b免疫球蛋白联合,对PBS透析,集中。使用这个程序,我们能够净化只有一小部分(< 10%)的anti-GQ1b病人血清免疫球蛋白呈现在原始的;大多数与血清筛选了一部分在第一洗。 It cannot be excluded that this fraction contained antibodies reacting with other ganglioside epitopes.
Anti-Ach受体(乙酰胆碱受体)抗体测定等作为描述。15GQ1b和GM1抗体的ELISA和点状化验所描述。16、17⇓纯化免疫球蛋白分数也检查所描述的效果。4
录音技术和统计数据。
灌注macro-patch夹技术在鼠标偏侧膈。
实验进行的雄性BALB / c小鼠偏侧膈至少16周大,在20±0.5°c所描述。8终板电流记录通过灌注macro-patch夹电极详细描述了其他地方。18、19⇓统计分析了商业计算机程序(起源、Microcal软件、Northhampton MA)。统计p使用学生的计算值t以及分组数据。
在每个实验的开始,电极模型包括了控制解决方案,电极的位置进行优化,量子兴奋性突触后电流(qEPSC)记录和统计。记录条件稳定时,稀释血清或免疫球蛋白溶解(1:4)N2-hydroxyethylpiperazine -N2-ethanesulfonic(玫瑰)缓冲区的浓度大约4至6毫克/毫升(除了部分纯化anti-GQ1b和枯竭的免疫球蛋白g分数)被添加到灌流液的电极在记录从一个选定的神经终端由一个固定的去极化电流脉冲刺激。局量子的内容”m”给出均值±SD从至少三个独立实验的结果。
结果。
MFS血清或免疫球蛋白的影响突触前释放发射器。
应用血清或免疫球蛋白g的所有11 MFS患者显著降低局量子的内容,而控制免疫球蛋白无阻塞效应(图1)。封锁MFS-IgG或MFS-sera可以完全逆转洗四11名患者与控制解决方案,和六11部分患者。在只有一个血清(病人3),封锁是不可逆的。最后每个血清或免疫球蛋白的影响研究中所示表1。
图1所示。减少局量子的内容由米勒费雪症候群(MFS)纯化血清或免疫球蛋白G(免疫球蛋白)。纵坐标:局量子的内容相对于控制规范化1为每个实验;值作为平均数±标准差。结果11个不同MFS(1 - 11)患者和患者健康的捐赠者的集中免疫球蛋白制剂(控制)。
在每一个病人,封锁可以克服由神经终端更强的去极化8(数据未显示),证实突触前的封锁,排除技术故障,观察到的量子内容下降的原因。
此外,我们研究了血清,纯化免疫球蛋白g和免疫球蛋白分数丰富anti-GQ1b抗体的效价高的病人(病人11)分别anti-GQ1b抗体(血清1:3,200)。所有分数显示阻塞属性显著减少诱发量子释放。平均减少局量子的内容米相对于整个控制血清(1:4稀释)为0.26±0.04;和纯化MFS-IgG浓度为2.6 mg / mL, 0.22±0.03。anti-GQ1b抗体的免疫球蛋白g分数丰富更低的免疫球蛋白浓度为0.036毫克/毫升,和诱发更强了十倍减少局量子的内容(米= 0.029±0.01)。相比之下,从anti-GQ1b抗体免疫球蛋白分数部分耗尽(残余anti-GQ1b效价1:400)更有效地阻止诱发量子释放(米= 0.43±0.15)在一个等价的免疫球蛋白浓度。
MFS血清或免疫球蛋白对突触后电流的影响。
Macro-patch夹分析。
探讨突触后MFS血清振幅的行动(qEPSC)进行分析。图2描绘了振幅分布之前、期间和之后的应用MFS-IgG病人11。在控制条件下(见图2一个),柱状图显示两座山峰表示单引号和双量子的释放。对单量子,平均振幅是−1648 pA。即使是最小的振幅是远高于记录系统的噪音水平。在MFS-IgG的存在(见图2 b),平均振幅控制相比明显降低。由于突触前封锁,只有单量子释放,直方图显示只有一个峰值平均振幅−1200 pA。冲洗后,平均振幅和分布控制条件(见几乎是相同的图2 c)。在MFS-serum的存在,振幅的单量子减少10的11例;这10个病人在七,振幅恢复完全冲洗后(表2)。
图2。振幅分布局量子的兴奋性突触后电流(qEPSC)之前,期间和之后的应用米勒费雪症候群(MFS)免疫球蛋白G(免疫球蛋白)。纵坐标:每本数量的观察。Abscissae:振幅qEPSC以恒定的去极化电流(−0.4μa),宽度200 pA。(一)控制解决方案;局量子的内容米= 0.7。(B) MFS-IgG病人11;局量子的内容米= 0.2。(C)冲洗(控制解决方案);局量子的内容米= 0.5。所有数据记录来自同一神经终端。评估每个分布的记录数量在1500年到3000年,根据局量子的内容。实线是单个量子的高斯分布。
外部膜片箝分析。
研究的突触后影响MFS-IgG避免干扰突触前萧条的版本中,我们调查了五个病人的MFS-IgG膜片钳技术在外部配置鼠标肌管。峰值电流幅度引起的饱和浓度1.0毫米Ach评估之前,期间和之后孵化的外部补丁各自MFS-IgG浓度。代表性的实验显示的时间进程和封锁的可逆性的峰值电流振幅MFS-IgG中描述图3。在70 mg / L MFS-IgG病人5日Ach-induced电流的振幅在20秒内降低了约97%。振幅在冲洗在60秒后完全康复。的程度减少乙酰通道电流幅值及其时间进程取决于MFS-IgG浓度。剂量反应关系时最大0.7和7.0 mg / L MFS-IgG之间添加到背景的解决方案。而块的时间进程取决于MFS-IgG集中应用,冲洗的时间是独立的(数据未显示)。时间的激活和脱敏MFS-IgG乙酰通道电流没有改变的(数据没有显示)。每个MFS-IgG准备接受外部的调查的最终效果分析进行了总结表3。应用程序控制免疫球蛋白g从健康的捐赠者和两个其他神经系统疾病患者无阻塞的效果。
图3。浓度降低峰值电流振幅由米勒费雪症候群(MFS)免疫球蛋白G(免疫球蛋白)病人5。单脉冲振幅的1.0毫米乙酰胆碱外部补丁是策划和时间。应用脉冲频率为0.25赫兹。单杠表明免疫球蛋白应用程序期间各自的免疫球蛋白浓度。注意减少峰值电流振幅是更快和更明显高的抗体浓度。
恢复期的血清对量子的影响内容和qEPSC。
进一步研究观察到的致病相关屏蔽效应,从疾病的急性期血清血清后获得在同一神经终端(完全康复了图4)。从病人应用MFS-IgG后1在疾病的高度,量子释放5分钟内几乎完全阻塞。回到控制解决方案,局量子的内容在7分钟内完全康复。与恢复期的血清中溢出,量子内容保持稳定在同一水平上超过30分钟。单量子的幅度和衰减时间常数是恢复期的血清的影响,表明最初的突触后效果也消退了。所示的实验图4是这种类型的代表9个实验用三个不同的患者的血清(看到了吗表1和2⇑)。
血清抗体。
具体反应GQ1b神经节苷脂被发现在ELISA效价高和点状化验的11例免疫球蛋白,但不是IgM的分数。没有发现IgM或免疫球蛋白结合GM1。在两个病人(患者9和10),没有anti-GQ1b anti-GM1 ELISA抗体可以检测标准。随访患者血清学2到6个月后,特定的免疫球蛋白g绑定这些神经节甘脂已经消失了。没有一个病人的血清显示浓度升高(> 0.4 nmol / L)的抗体标准免疫沉淀反应测定乙酰胆。
讨论。
我们的研究表明,神经肌肉阻断抗体在MFS很常见。Postsynaptically,抗体直接干扰乙酰胆碱受体通道。血清失去了预处理和突触后阻塞所有属性后完成临床康复。
突触前由MFS-IgG封锁。
诱发的突触前抑郁量子释放可能解释的干扰MFS-IgG电压门控钙通道8的作用(就像Lambert-Eaton肌无力的症状(氨基酸)免疫球蛋白26日,27日⇓),或者可能表明变化释放机械类似肉毒杆菌毒素的作用。28后期版本中我们发现略有增加,可能反映了应用MFS-IgG后自发释放增加。8我们没有观察到深刻的增加自发释放之后,完全无反应性神经终端所述沐浴后孵化整个神经肌肉的准备与MFS血清一起积极补充。6,9⇓我们刺激和治疗只有一小块的突触,19合并后的预处理和突触后封锁是没有添加积极补充,也许可以解释一些基本的差异比较结果发表在浴应用长时间孵化和胞内记录。9日,29日⇓因为补充独立和可逆性的封锁,我们的数据是最好的解释为一个immunopharmacologic免疫球蛋白抗体的影响。一个假设调和这两个观测结果将这些抗体的不同但互补的功能,不像重症肌无力的情况,补体依赖的改变和乙酰胆碱受体的直接immunopharmacologic封锁是手术。30、31日⇓
突触后封锁。
MFS-IgG的额外的行动在突触后乙酰频道首次发现与macro-patch夹技术证实了,现在是一个独立的效应,单通道测量。我们的数据表明绑定的MFS-IgG nonliganded AchR-channel,作为描述肌无力的抗体。22日,31日⇓因为特定的活动的确切数额IgG-fraction是未知的,绑定和释放的速率常数是不计算。封锁的时间进程MFS-IgG似乎略高于纯化免疫球蛋白的重症肌无力患者。22尽管乙酰胆功能MFS抗体作用的证据,绑定MFS-IgG没有发现的诊断免疫沉淀反应试验。这并不出人意料,因为抗体结合位点附近的绑定或乙酰渠道通常不被诊断免疫沉淀反应试验。15日,32⇓macro-patch当对比观测获得的与外部获得的膜片钳夹技术方法,必须考虑到乙酰胆碱受体的抗体可能没有那么容易准备一个完整的神经肌肉的肌小管表达乙酰胆频道。这也许可以解释定量差异存在剂量-反应关系。由两个独立的方法,获得的数据有很好的一致性,清楚地表明突触后MFS-IgG的效果。MFS-IgG像我们之前发现的结果从GBS患者免疫球蛋白分数,然而也有一些显著的不同之处。19在我们的实验与GBS血清中,突触后电流在10个病人中只有四个影响。此外,封锁的时间进程与GBS-IgG往往较慢,和封锁引起GBS-filtrate经过长时间的孵化时间不能逆转。可想而知,不同antiganglioside抗体显示不同模式的绑定和神经肌肉的封锁。
anti-ganglioside抗体的可能角色。
从目前的数据,没有提示是否阻止抗体是针对一个同源抗原决定基表示两个预处理和postsynaptically,或者这是否结合阻塞作用是由于多克隆抗体免疫反应与多个针对不同抗原表位。许多不同的研究表明,GQ1b MFS候选抗原,9日,29岁到三十五⇓⇓⇓⇓但anti-GQ1b抗体的公认的致病作用仍然是投机由于实验数据还没有直接的证据。我们的调查使用anti-GQ1b抗体的免疫球蛋白部分丰富也不明确证明GQ1b的致病性相关神经节甘脂,因为大与其他神经节苷脂抗原表位的可能性不能排除。这一事实anti-GQ1b抗体不再检测到复苏后,随着阻塞活动的损失,是暗示但没有确凿的证据。未来的研究应该利用单克隆免疫球蛋白抗体绑定只GQ1b。
在两个11个病人,我们并没有发现可检测anti-GQ1b抗体ELISA,虽然他们的血清减少诱发量子释放程度类似于anti-GQ1b阳性血清。我们假设我们的检测系统(ELISA和点状)可能未能检测效价低的活动,正如前面所描述的。36、37⇓具体地说,我们的试验使用牛脑神经节甘脂,因此特定抗体周围神经神经节甘脂可能不能被检测到。的确,对于血清anti-GM1抗体,不同的结合亲和力神经节甘脂来源于周边和中枢神经系统已经在GBS患者描述。38、39⇓另外,抗体可能没有被ELISA检测由于构象差异,尽管他们可能功能活跃。这将类似的发现在某些患者血清反应阴性的重症肌无力。22最后,它不能排除功能相关的抗体反应glycoconjugates GQ1b。
确认
支持部分由德意志Forschungsgemeinschaft (Bu-398/3-2),由Gemeinnutzige Hertie Stiftung和大学基金(Klinische德国毛皮多个Sklerose和Neuroimmunologie);电视节目也Associazione Italiana Sclerosi Multipla和意大利(批准号674)。
承认
作者感谢m . Piepenschneider和j . Zielasek博士执行GM1抗体GQ1b化验,医生答:Weishaupt净化的免疫球蛋白抗体,和美国Allaria技术援助。作者还要感谢美国Besinger博士和c比肖夫提供患者在护理和信息收集血清样本。
脚注
*这些作者的贡献同样这项工作。
- 收到了2000年2月21日。
- 接受2000年9月12日。
