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我们开发了一个多克隆抗血清指向人类的γ-isoform 14-3-3相比,蛋白质和商用抗体的免疫反应性(CG31)。我们分析了14-3-3 253年脑脊液样品通过免疫印迹和ELISA诊断蒙蔽,与常用的多克隆抗血清(sc - 731)和γ特定抗体。我们的病人人口由52名患者明确的零星克雅二氏症患者(sCJD)和201不同的最终诊断。我们获得了类似的敏感性,与所有抗体从96%到98%不等。假阳性的所有的样品与sc - 731, 50%是消极与γ-isoform特定抗体导致更高的特异性(85%v分别为93%)。如果只有sCJD和痴呆患者不同于sCJD分析我们发现,64%的假阳性呈阴性也导致显著增加的特异性和阳性预测值。
γ-isoform特定强烈提高特异性抗体的免疫印迹和可能提高世界范围内接受14-3-3的使用分析sCJD的鉴别诊断。
- AA,氨基酸
- 盟,任意单位
- CSF,脑脊液
- ELISA酶联免疫测定
- FP,假阳性
- 从sCJD OD,痴呆患者不同
- 的生命,其他神经系统疾病
- sCJD,零星的克雅二氏症
- TP,真积极
- 脑脊髓液
- ELISA
- 免疫印迹
- 量化
来自Altmetric.com的统计
最常见的人类朊病毒病是零星的克雅二氏症(sCJD),用一个近似一个病人的发病率每年每百万居民。确诊sCJD需要神经病理学研究。1宰前诊断,积极的脑脊液(CSF) 14-3-3试验是“可能的”添加到标准sCJD由世界卫生组织(世卫组织)。2尽管许多研究3 -8报道的重要性14-3-3 sCJD的诊断分析,其他的研究要求不够具体在庞大的人口作为一个真正的诊断测试。9日,10假阳性结果患者的急性或亚急性神经破坏和在一些患者痴呆。11假阴性结果描述主要在早期阶段或sCJD病程长的患者。试验的解释和假阳性的数量继续讨论的问题。
14-3-3蛋白的分子量30 kDa和七个已知亚型(εβ,γ,η,τ,和φ)。12ε的亚型β,γ,η已确定患者的CSF sCJD。5,13
本研究的目的是探讨抗体直接针对γ-isoform能否提高鉴别诊断。我们通过使用新的分析了敏感性和特异性抗体在52 sCJD人口和201年控制病人谁曾一个明确的诊断。接下来,我们调查是否定量酶联免疫分析法(ELISA)将提高我们的结果与主观的免疫印迹技术。
材料和方法
我们实验室执行14-3-3的CSF分析整个比利时。当一个医生怀疑sCJD脑脊液样本和所有相关临床资料寄给我们。我们研究的临床资料,进行14-3-3化验,并讨论结果与神经学家。后来病人随访的临床状态。死后或6 - 12个月后临床医生报告最后诊断,和,如果适用的话,神经病理学调查完成。
自1998年以来,我们已经分析了脑脊液样本393名患者被诊断为“可能”sCJD。11为261例(66%)病人最后的诊断测试可以使用临床或神经病理跟踪数据。我们进一步排除三个世袭朊病毒疾病患者和5 sCJD患者仍然是“可能的”由于缺乏神经病理证实。因此我们最后的研究人群包括253名患者。在本系列中三个不同的组的患者可以确定:患者sCJD (n = 52),老年痴呆症患者不同于sCJD (OD, n = 140)、和其他神经系统疾病患者(核能开发局,n = 61)(表1)。
标准14-3-3进行分析(如前所述)。4,14墨迹孵化了sc - 731(圣克鲁斯公司,圣克鲁斯,CA),这是针对γ-isoform但承认多个亚型。13每一个污点包括人类大脑匀浆(0.1毫克的总蛋白)积极控制和脑积水的患者的CSF -控制。样品被认为是积极的,当免疫印迹显示活性的电泳淌度类似于积极的控制。所有脑脊液样本测试两次,如果矛盾,第三个测试最终完成评估。
我们分析了氨基酸(AA)的所有14-3-3亚型序列使用瑞士Prot数据(http://us.expasy.org/sprot/),选择2γ特定抗原表位:AA - 12和235 - 245。肽都是注入相同的兔子和帕布组合生成。获得的抗血清被使用初始肽亲和色谱法纯化。分析显示一个最优的信号γ14-3-3帕布在1:50 0稀释混合。我们进一步分析了最近可用的商业单克隆抗体(mAb)和获得最优结果与1:750稀释(CG31 Biocarta公司,德国汉堡)。接下来,我们检查了每天八个样本的方差(四个明确的sCJD,两个阿尔茨海默病(AD)和路易体痴呆和多发性硬化症)连续三天,一个星期后。两个独立的观察者的视觉分析导致相同的评估在所有场合。组合这些抗体夹心ELISA进行了研究。ELISA的内部和interassay精度总是低于10%。免疫印迹和ELISA我们使用相同的脑匀浆作为积极的标准。
结果
我们分析了253份脑脊液样本14-3-3使用三个不同的抗体的存在。使用sc - 731帕布样品我们确定了14-3-3 81年的51是真的阳性(TP)和30假阳性(FP),这意味着除了sCJD最终诊断。应用CG31我们发现50 TP和16 FP而γ14-3-3帕布导致50 TP和15 FP(表1),我们发现类似的敏感性但显著增加特异性CG31马伯和γ14-3-3帕布与sc - 731帕布(85%相比v分别为92%,表1)。
OD人群我们发现14的乐队(64%)与sc - 731没有任何免疫反应性与γ特定抗体导致增加的特异性和阳性预测值反应组(表1)。我们发现,五个乐队(31%)与γ-特定的抗体与sc - 731。这个改进没有导致显著增加特异性(74%v分别84%,表1)。
在一些免疫印迹微弱的乐队是可见的,但得分为负(图1巷4),这表明使用主观免疫印迹的难度。因此,我们开发了一个“量化”夹心ELISA技术。
14-3-3蛋白免疫印迹检测使用sc - 731帕布(通道1 - 4)和CC31马伯(道5 - 8)。分子标记是描绘在左边(结束)。乐队的积极控制(BH、脑匀浆)和库贾氏症患者(库贾氏症)总是得分为正数。与sc - 731帕布样例阿尔茨海默病(AD)患者积极和桥本的脑炎患者的样本(他),导致只有非常微弱的乐队,得分为负。CG31马伯广告和他是负样本。
积极的光密度标准,脑匀浆,ELISA是扳平比分1任意单元(AU)在所有测试。最好的信噪比,得到了标准曲线时,sc - 731帕布是用来捕获和CG31马伯检测。我们发现了一个中等水平的1.00 AU 14-3-3蛋白质sCJD患者使用ELISA(范围0.23 - -1.96 AU)。在不同的患者最终诊断我们发现平均0.23 AU(范围0.07 - -1.90 AU)。两个组的结果明显不同与Mann-Whitney U检验(p < 0.0001)。OD患者平均0.18 AU(范围0.10 - -1.60 AU)被发现在反应患者平均0.23 AU(范围0.07 - -1.90 AU)。这两个组显著不同的结果从sCJD组(p < 0.0001),然而,两组之间没有显著差异。
诊断使用的最优截止值0.28 AU是由接收机工作特性分析。使用这个截止我们获得94%的敏感性。我们发现85%的特异性反应组,痴呆组96%,整体平均水平为93%。这些结果并不不同于通过主观γ-isoform特定的免疫印迹分析。
讨论
我们发现γ-isoform执导的特异性抗体显著增加14-3-3试验而不降低灵敏度特别是不同类型的痴呆患者。这是进一步发现支持的鉴别诊断意义不变通过定量ELISA试验而主观免疫印迹技术。
这和我们之前的研究的结果4,15非常类似于其他欧洲实验室报告的高敏感性和特异性(> 85%)。3 -8另一方面,一些亚洲和美国团体报道低特异性类似的技术。9日,10日,16日,17这些差异很可能是由于使用的标准样本的选择。我们的研究结果清楚地表明,一些神经系统疾病,可以暂时模仿sCJD,如血管、感染、炎症性脑病可能导致假阳性,应该排除在分析(表1)。
14-3-3分析的另一个缺陷是软弱带的存在,被认为是积极和微弱的乐队被视为消极如果他们的信号是相同的所有三个检查的屁股。以前,我们表明,光密度分析,与视觉分析相比,14-3-3会导致增加特异性和灵敏度较低。4因此,这种技术没有进一步探讨。在这项研究中我们描述了一种ELISA技术,也有类似的特异性和免疫印迹可以是一个有价值的选择。4
最近的研究也表明,τ蛋白和Aβ的测量1-42在脑脊液了验收sCJD的鉴别诊断。11日,15不像Aβ1-42sCJD正常或减少,非常高的τ蛋白水平对sCJD可以诊断。14日,18
临床数据的相关性和小说γ-isoform特定抗体的可用性可能会提高世界范围内接受14-3-3的使用分析sCJD的鉴别诊断。
确认
作者感谢所有医生发送疑似sCJD患者的脑脊液样本和临床信息和控制情况下,科学研究基金(FWO)支持这项研究。
引用
脚注
本研究支持的科学研究基金(FWO)。BVE的博士后科研基金(FWO)。
利益冲突:没有宣布