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摘要目的:调查各种脑脊液(CSF)标记能够协助克雅氏病(CJD)的临床诊断。
方法:脑脊液样本分析14-3-3蛋白的存在,微管相关蛋白,β淀粉样蛋白在250年可能库贾氏症患者。光密度分析被用来量化的水平14-3-3在所有的病人。
结果:临床资料的分析表明,小脑迹象或肌阵挛结合进行性痴呆的主要功能是导致临床怀疑库贾氏症。而14-3-3检测的敏感性为100%,特异性为92%,使用阈值τ决心1300 pg / ml的敏感性为87%,特异性为97%。如果14-3-3被修改的协议分析(使用光密度分析)可以获得更高的特异性(97%),但灵敏度较低(96%)。最大的灵敏度,特异性,阳性预测值得到14-3-3和β淀粉样蛋白的结合决定。14-3-3的浓度和τCSF减少在库贾氏症患者疾病的长期(一年以上;p < 0.05)。最低14-3-3的浓度或τ发作或在最后阶段的疾病,而β淀粉样蛋白的浓度保持在一个低的疾病。
结论:14-3-3和τ蛋白都是敏感的和特定的生物标记库贾氏症。14-3-3和β淀粉样蛋白分析的结合导致了最大的灵敏度,特异性,阳性预测值。当这些生物标记物用于库贾氏症的诊断,疾病的阶段的脑脊液样本应该考虑获得的。疾病持续时间,依赖于PrP基因型,也有一个显著的影响14-3-3和τCSF水平。
- 根据大量
- Jakob疾病
- 脑脊液标记
- 诊断
来自Altmetric.com的统计
零星的克雅氏病(CJD)是一个快速进步,最终致命的障碍属于群朊病毒疾病。1到目前为止,一个明确的诊断只能由尸检脑组织神经病理学的检查。2临床上,“可能的”库贾氏症的特点是快速进行性痴呆(不到两年的时间)和至少两个以下的症状:肌阵挛,视觉符号,锥体束外的或锥体迹象,无着丝粒的缄默症,和小脑的迹象。3病人表现出典型的脑电图(EEG)与三相的重复的慢波为14-3-3蛋白复合物或积极的测试被归类为“疑似库贾氏症”。4
脑脊液(CSF)中的几个蛋白质可以帮助库贾氏症的临床诊断。Immunodetection 14-3-3蛋白5和τ蛋白6据报道是最敏感和特定的标记,但这些蛋白质也发现与重叠的其他疾病的临床症状。增加神经元特异性烯醇酶7或s - 100蛋白8已报告,但不太敏感的和具体的。9降低浓度的全长脑脊液β淀粉样蛋白1-42 (Aβ1-42)是经常发现在库贾氏症患者中,尽管他们仍然正常或可能增加其他神经系统疾病的生化检测结果和临床迹象表明模仿库贾氏症。10日,11
后的描述库贾氏症的变体形式12和随后的实验与牛海绵状脑病建立链接,13日,14监测网络成立于比利时监控库贾氏症的发病率。作为监测网络的一部分,我们的实验室检查临床怀疑库贾氏症患者的250份脑脊液样本。所有这些病人是医生提供了一个总结的临床记录包括历史、发病症状,并跟踪信息。
在这项研究中,我们评估使用脑脊液生物标志物和临床和实验室分析变量。首先,我们调查了在库贾氏症和对照组临床症状来确定病人的标准被怀疑患有库贾氏症。第二,我们研究了CSF标记,单独或结合,是最有用的。第三,我们进行了一次14-3-3的光密度定量免疫印迹分析。最后,我们分析可能的影响,如年龄、疾病持续时间、腰椎穿刺,和遗传多态性朊蛋白基因的密码子129 (PRNP)脑脊液生物标志物。例如,它已经表明,τ蛋白的水平取决于患者的年龄。15这些结果对质量控制很重要,也允许一个临床诊断协议的发展。
方法
未来的CSF研究于1998年9月开始,所有样品直到2002年6月30日获得被包含在目前的分析。我们收到了250个患者的脑脊液样本临床症状符合当时“可能的”库贾氏症的诊断腰椎穿刺。库贾氏症的诊断是根据标准标准。16神经病理证实了临床诊断标准的方法。17如果跟踪信息显示另一种诊断、适当的诊断标准是开水的例子,对阿尔茨海默病研究所的标准是那些交际障碍和中风和阿尔茨海默病及相关疾病协会(NINCDS-ADRDA)。18
免疫测定14-3-3蛋白是由Zerr描述等,小的修改。19日,20.短暂,20μl CSF受到钠十二烷基硫酸/聚丙烯酰胺凝胶电泳(pH值8.2)(叠加6% / 12%的分离胶在75 V为60分钟)使用Mini-Protean™电泳细胞(Bio-Rad,赫拉克勒斯,加州,美国)。蛋白质转移到硝酸纤维素(Hybond;Amersham,欧洲生物科学,德国弗莱堡)15 V 24分钟使用Trans-blot™半干电泳转移细胞(Bio-Rad)。一组分子量标记(万花筒prestained标准,Bio-Rad)和一个标准的正样本(脑匀浆)被用于所有实验。免疫染色完成后阻塞与磷酸缓冲盐(pH值7.5)包含2%的脱脂牛奶,通过孵化anti-14-3-3γ兔多克隆抗体(圣克鲁斯生物技术sc - 718,圣克鲁斯,加利福尼亚,美国)1:20 00稀释。随后,细胞膜是孵化与碱性磷酸酶共轭猪anti-rabbit IgG抗体(Dako D0306,斯特鲁普,丹麦)1:20 00稀释。抗原检测到一个比色反应使用0.02%氮蓝四唑(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)和0.02% X-phosphate / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl磷酸(勃林格殷格翰集团,德国)。存在与否的污点是得分30 kDa的免疫反应性的乐队。乐队被确认为“强有力”的时候等于比乐队的积极控制。其他的乐队强度较低的被贴上“软弱”。 For each signal the integrated optical density was measured and quantified using a Kodak image station 440 and accompanying software. These measurements were used to calculate the ratio of each signal to the positive standard, which was identical on all blots. The result of this calculation was expressed in arbitrary units (AU).
的Aβ1-42浓度是决定如前所述。10日,21τ蛋白浓度测定在复制一个酶联免疫吸附测定(Innotest hTau-Ag, k - 1032;Innogenetics,根特,比利时)。22129年PRNP密码子多态性决心如前所述。23
数据分析
在分析影响脑脊液生物标志物和临床特点,我们汇集数据在所有三个对照组(见下文)阿尔茨海默氏病,其它痴呆,神经系统疾病纳入一个对照组。我们只使用光密度14-3-3数据的分析。研究的影响的时间点取样的过程中,我们选择了三个任意阶段:“早期”,第一个25%;“晚”,最后的15%;和“中产”,占总数的25%和85%之间疾病的持续时间。这些选择是提高清晰的结果和简化统计分析。
Kolmogorov-Smirnov测试(InStat软件包)表明,结果没有一个正态分布(p < 0.05)。因此分析连续变量是使用百分位数和Mann-Whitney U测试完成的。为名义变量使用确切概率法。不同变量之间的关系和生物标记物的水平在人口的基础上计算使用皮尔逊测试。比较分析了不同标记的结果使用χ2测试。最优切断值计算使用接受者操作特征(ROC)分析。
结果
临床数据
临床数据和脑脊液样本可供250可能库贾氏症患者。在47个,证实了库贾氏症神经病理学的诊断,而在五库贾氏症的进一步可能的情况下这是不可能作为验尸被拒绝的许可。均值(SD)的年龄库贾氏症组(n = 52) 63年(8)。
其他剩下的198名患者使用跟踪信息进行了诊断。病人被分配到三个类别:阿尔茨海默病,其它痴呆和其他痴呆是一个次要症状的神经紊乱。第一组包括65老年痴呆症患者,意味着(SD) 71(8)岁。六十二例其它痴呆形成第二组;这些有如下诊断:血管性痴呆(n = 26),额叶痴呆(n = 13)、路易体痴呆与(n = 23)。这一组的平均年龄是69年(8)。第三组包括71名患者与其他神经系统疾病,包括病毒性脑炎(n = 18),桥本的脑炎(n = 6),多系统萎缩(n = 5),多发性硬化症(n = 3),中风(n = 10),代谢功能障碍(n = 12),副肿瘤综合征(n = 10),和精神障碍(n = 9)。这一组的平均年龄是64(13)年。有年龄这三组之间无显著差异。
生化决定
对所有生物标志物分析我们首先检查每天8样本方差(四个明确的库贾氏症,两个阿尔茨海默病,一个与路易体痴呆,和一个与多发性硬化症)连续三天,一个星期后。视觉分析14-3-3蛋白总是导致同样的评价。在这些墨迹的光密度分析,发现3%的方差。τ和Aβ1-42浓度与公布结果,方差小于5%。10日,11日,22日,24 -26
14-3-3蛋白是存在于所有库贾氏症患者。一个积极的信号也被发现在血管性痴呆患者和5与病毒性脑炎。疲软的14-3-3乐队在三个代谢障碍引起的痴呆患者,三个与路易体痴呆,两个与阿尔茨海默氏症。
标准化的解释免疫印迹,我们进行了密度测量信号的分析。在库贾氏症患者平均的1.44 AU 0.25到8.52 AU被发现。对照组(汇集数据),平均是0.00个天文单位的0.00到0.86天文单位。信号密度之间的差距显著库贾氏症患者和对照组(p < 0.01)。如果我们选择积极的对照组中标识样本,平均0.48 AU的范围从0.12到0.86 AU被发现;这是明显不同于库贾氏症组(p = 0.02)。最大的敏感性(96%)和特异性(97%)获得当切断值0.60 AU (ROC分析)。
CSF标记为临床诊断的价值
切断值1300 pg / ml被用于分析脑脊液τ蛋白的浓度。26我们发现增加特异性(98%),但一个较小的敏感性(87%)比14-3-3免疫印迹。另外,我们研究了对照组和观察之间的差异τ蛋白浓度的增加在阿尔茨海默氏症(625 pg / ml)相对于其他神经系统疾病(450 pg / ml) (p = 0.05)。
CSF Aβ浓度没有显著差异1-42库贾氏症和控制之间的观察组(分别为304和293 pg / ml)。我们确定一个显著增加Aβ的浓度1-42在控制结果假阳性患者14-3-3 (605 pg / ml, p = 0.04)。阿尔茨海默病组(246 pg / ml)和其它痴呆组(289 pg / ml)明显降低Aβ水平1-42与神经系统疾病对照组(346 pg / ml) (p < 0.05)。
识别最好的单一的测试中,我们比较了14-3-3和τ检测率(表1)。我们发现光密度分析,14-3-3给了最好的总体结果但没有明显不同于其他14-3-3测试使用。14-3-3测试灵敏度高于τ,而τ特异性较高(p < 0.02;表1)。
如果我们结合τ的分析或与Aβ14-3-31-42,使用一个切断值400 pg / ml,我们获得一个更高的特异性(p = 0.01;表1)和一个不变的敏感性为14-3-3,而获得的结果与τ的决心没有改变。14-3-3和τ分析没有增强敏感性和特异性。
虽然痴呆是存在于所有的病人,一些最初的神经或精神的迹象。肌阵挛,视觉问题,小脑体征通常标识(图1),至少其中之一是出现在所有的病人。视力问题是更常见的在库贾氏症组(p = 0.03)。相同频率的锥体和锥体束外的迹象被发现在所有组。典型的脑电图变化(敏感性50%,特异性82%)和运动不能的缄默症,另一方面,很少是描述的对照组患者(图1)。
流行的迹象和症状明确克雅二氏症病人和控制。脑电图,脑电图;每股收益,锥体束外的标志。
我们进一步比较样本之间的所有生物标志物的水平被冷却(在4°C)或冷冻和发送在室温下库贾氏症组(表2)。我们分析了样本的时间是否保持在室温下在运输有任何影响的结果,但没有观察到显著差异。
接下来我们分析年龄时采样的影响(表3)。我们没有观察到任何标志的显著差异。为分析疾病的持续时间、两种不同的测量。库贾氏症,总是致命的,我们使用总疾病持续时间,而在对照组我们使用疾病的持续时间点取样。这样做是由于一些病人仍然活着,因此最后的时间还不知道,也因为有些病人康复。我们发现水平显著降低(τ)和14-3-3蛋白在病程长的患者两组(p < 0.03)(表3)。这些计算完成时分别为不同的对照组,减少水平仍然可以观察到但程度较轻,因为较小的样本量为τ(p = 0.05, p = 0.06 14-3-3)。
我们还研究了129年PRNP密码子多态性的影响在库贾氏症患者脑脊液生物标志物的水平。我们发现14-3-3和τ蛋白水平降低患者遇到/瓦尔(n = 12)和Val /瓦尔(n = 7)相比,遇见/见到(n = 33)。由于小样本大小这种差异只是发现重大当数据满足/ Val和Val / Val患者合并(表3)。当多变量分析是为了纠正疾病持续时间这一效应的影响不再显著。
最后,我们评估的影响时间点取样的病程。我们检查了汇集数据库贾氏症(42例)和对照组(n = 75)在人总疾病持续时间和阶段的样本是已知的。我们发现对于库贾氏症患者,样本在疾病的早期和晚期14-3-3水平显著降低,τ与样本在中间部分的疾病持续时间(p < 0.001;表4),控制患者的这种效果只是看到τ蛋白(p < 0.02;表4)。当多变量分析是为了正确的总持续时间的影响疾病的这种效果还是显著(p < 0.05)。
在五个库贾氏症患者我们收到连续两个样品。在这个小组中发现显著差异也可以14-3-3和τ水平(0.79“早期”:14-3-3蛋白,非盟;τ蛋白,1290 pg / ml;“中间”:14-3-3蛋白质,1.52盟;τ蛋白,8923 pg / ml;p < 0.04)。
讨论
在本文中,我们报告的前瞻性研究结果对CSF在我们实验室进行合作与比利时库贾氏症监测网络。我们研究了14-3-3测试和其他标记CSF作为鉴别诊断的工具。我们检查了14-3-3免疫印迹结果通过视觉分析和密度测量分析,发现无显著差异。
症状的分析当时的样品交付表明痴呆与小脑体征或肌阵挛的组合最常引起怀疑库贾氏症。最具体的临床症状的鉴别诊断是无着丝粒的缄默症和周期性大幅脑电图波复合物。跟踪信息显示,阿尔茨海默病是最常见的鉴别诊断,其次是血管性痴呆。
14-3-3测试5,9日,19日,27和tau蛋白的决心6,24日,25(切断1300 pg / ml)都是可靠的分析用于库贾氏症的临床诊断。在本系列中,我们观察到14-3-3测试比τ的决心更敏感(100%)(87%)。另一方面,τ的决心有特异性(98%)大于14-3-3的测试(93%)。这些结果符合进行的研究的结果类似。9报告的Aβ浓度1-42对照组和τ是不同于其他发表的报告中发现,9日,26但是,当我们分析Aβ1-42或τ为每个组分别,我们发现类似的结果。我们确认的报道早期崛起τ库贾氏症患者,也确定了低水平的14-3-3蛋白质。
我们的研究证实,CSF Aβ的浓度1-42增加在某些神经疾病能暗示库贾氏症症状和积极的14-3-3或τ测试。10日,1114-3-3测试结合Aβ的检测1-42导致显著增加特异性(98%,p = 0.01)。这是重要的区分从临床上可能库贾氏症可以治疗的疾病。
我们没有发现影响结果的样品在室温下长期保存,或样本的方式发送到实验室,或病人的年龄。另一方面,疾病持续时间和PRNP密码子129相关显著,但影响14-3-3和τ蛋白分析的结果。这是因为大多数患者疾病的长期(一年以上)也遇到了/ Val或者Val / Val基因型。我们的结论是,样本在病程早期或晚期可能产生假阴性或弱阳性结果。
我们因此愿意提出以下策略与可能或可能库贾氏症患者的负面生物标志物分析。如果库贾氏症的临床症状仍暗示三个月后,重复分析应考虑。同时它也可能是有用的分析PRNP密码子129年这种影响生物标志物分析和疾病持续时间。
结论
检测CSFτ蛋白阳性预测值最高,而检测14-3-3蛋白质有最好的阴性预测价值。测试是同样的有价值的工具库贾氏症诊断(表1)。我们的研究进一步表明,14-3-3在脑脊液和τ蛋白水平显著降低在库贾氏症病程长的患者(一年以上)。独立于这个发现我们也观察到14-3-3或τ的水平最高的“中间”阶段的疾病,而浓度降低被发现的“早期”和“末”阶段,有时产生假阴性结果。这些变化与Aβ没有观察到1-42值。
确认
我们感谢所有医生给我们怀疑库贾氏症患者脑脊液样本和临床信息和控制情况下,和科学研究基金(FWO)支持这个项目。我们进一步感谢博士教授C Van Broeckhoven技术援助基因型和密度测量与分析。BVE的博士后科研基金(FWO)。
引用
脚注
利益冲突:没有宣布