文摘
的免疫调制剂2-amino-2 - [2 - (4-octylphenyl)乙基]1、探索(FTY720)有前途的治疗效果在多发性硬化症(MS),一种退行性疾病,中枢神经系统的髓鞘脱失是伴随着死亡的少突胶质细胞(OLGs) myelin-producing细胞。体内的磷酸化FTY720生成G protein-coupled sphingosine-1-phosphate的受体的激动剂,起着关键作用的脂质中介刺激OLG生存的neurotrophin-3 (NT-3)。女士FTY720的作用机制并不清楚,尽管这种药物在自身免疫性疾病的影响被认为源于它能够减少淋巴细胞浸润和炎症。有趣的是,我们现在发现FTY720对OLG祖细胞也有直接影响。治疗和FTY720导致激活这些细胞的细胞外signal-regulated激酶1/2和Akt,伴随着防止细胞凋亡。然而,FTY720还逮捕了OLG分化。重要的是,这种效应被NT-3中和,这不仅增强FTY720 OLG祖细胞诱导的生存,但也刺激了他们的成熟。总之,这些观察结果表明,除了它的免疫抑制功能,在女士FTY720还可以产生有益的影响直接行动OLG祖细胞。然而,发现这些细胞的分化FTY720块疗法与FTY720女士提出了一个问题:是否应该包括使用differentiation-enhancing NT-3等因素。这种方法将确保保护现有OLG祖池对免疫介导的侮辱以及刺激remyelination通过提高这些细胞的成熟。
多发性硬化(MS)是一种慢性退行性和衰弱疾病的中枢神经系统(CNS)的特征是炎症和髓鞘脱失(McQualter和伯纳德,2007年)。MS的病理特点还包括轴突退化(特拉普et al ., 1999)和少突胶质细胞的死亡(OLGs) (Barnett Prineas, 2004;Lucchinetti et al ., 2004),细胞在中枢神经系统髓鞘膜。尽管女士的原因仍然未知,血清抗体的存在不同的髓磷脂成分和多种炎性病灶的存在支持大脑和脊髓的想法为主的自身免疫系统组件。出于这个原因,大多数治疗方法包括抗炎药物和免疫抑制剂的使用。
2-Amino-2 - [2 - (4-octylphenyl)乙基]1、探索(FTY720,也称为Fingolimod)是最新的免疫调节因子在评价治疗这个女士的合成药物是由化学改性的ISP-I (myriocin),一个sphingosine-like真菌产生的代谢物Isaria sinclairii。FTY720已被证明延长同种异体移植物生存在不同的动物模型的移植千叶et al ., 1996),并产生一种保护作用在动物模型的自身免疫性疾病(Maki et al ., 2002;水岛et al ., 2004)。重要的是,几项研究已经评估的影响FTY720对急性实验性自身免疫性脑脊髓炎(运算单元)的动物模型治疗女士FTY720被证明在大鼠和小鼠症状改善实验性自身免疫性脑脊髓炎(Fujino et al ., 2003;韦伯et al ., 2004;Kataoka et al ., 2005),并伴随着抑制T细胞浸润(Brinkmann林奇,2002;Fujino et al ., 2003;Kataoka et al ., 2005)和减少促炎(白细胞介素- 6)的表达和炎症(白介素2和interferon-γ(IFN-γ)细胞因子(Fujino et al ., 2003)。此外,最近的随机临床试验结果显示显著减少的脱髓鞘病变和临床患者的疾病活动FTY720,进一步支持的承诺使用这种药物治疗复发的女士(卡珀斯et al ., 2006)。和FTY720积极行动的实验性自身免疫性脑脊髓炎女士一直归因于其隔离能力循环淋巴细胞,特别是T细胞,进入二级淋巴组织如淋巴结和派尔集合淋巴结补丁(Brinkmann林奇,2002;曼荼罗et al ., 2002)。然而,一些证据表明,FTY720还可能通过干扰起到额外的免疫调节作用树突状细胞功能(局域网et al ., 2005;穆勒et al ., 2005),通过抑制胞质磷脂酶A2和生产类二十烷酸在肥大细胞炎症介质(佩恩et al ., 2007)。从不同的实验室结果表明FTY720由鞘氨醇激酶磷酸化2型(SphK2) (Zemann et al ., 2006)生成(年代)-FTY720-phosphate (FTY720-P)。FTY720-P在结构上类似于sphingosine-1-phosphate (S1P),脂质代谢产物,近年来出现了一种强有力的中介在许多生物过程(赫尔和春,2007)。由于其相似性S1P, FTY720-P能够绑定到所有的高亲和性S1P受体S1P除外2(Brinkmann林奇,2002)。我们曾发现S1P信号起着关键作用的中介刺激OLG祖生存的neurotrophin-3 (NT-3) (赛et al ., 2005)。这个观察让我们假设FTY720可以像S1P OLG祖细胞有直接影响。这可能是特别有吸引力了多方面的证据表明,这些不成熟的细胞是至关重要的补充失去OLG人口和remyelination女士(赵et al ., 2005)。在目前的研究中,我们发现,治疗和FTY720 OLG祖细胞导致快速ERK1/2的磷酸化和Akt,两种酶参与细胞的生存途径。此外,FTY720保护细胞生长因子不足引起的凋亡细胞死亡,细胞因子和小胶质激活。有趣的是,FTY720似乎抑制OLG祖细胞的分化,这一现象被NT-3中和。综上所述,这些观察结果表明,FTY720的有益作用和女士可能在实验性自身免疫性脑脊髓炎不仅源于其免疫调节特性,还可能涉及到直接影响OLGs。这些行动可能会进一步加强与NT-3联合疗法。
材料和方法
材料。Percoll和脂多糖(LPS)从Sigma-Aldrich购买(圣路易斯,密苏里州)。生长因子减少人工基底膜是从BD(富兰克林湖,NJ)。FTY720从开曼群岛获得化学(安阿伯市MI)。的活性对映体FTY720-P (年代-FTY720-P,准备如前所述卢和比特曼,2006年)。NT-3和肿瘤坏死factor-α(TNF-α)来自PeproTech(落基山,新泽西)。所有细胞培养基成分来自Sigma-Aldrich。phosphoinositide-3激酶抑制剂LY294002 (PI3K),有丝分裂原细胞外signal-regulated激酶激酶(MEK)抑制剂PD98059和IFN-γ来自Calbiochem (CA)圣地亚哥。SphK抑制剂N, N-dimethylsphingosine (DMS)从BIOMOL获得国际(普利茅斯会议上,PA)。Anti-phosphorylated ERK1/2 (P-ERK1/2)和anti-total ERK1/2 (T-ERK1/2)抗体购自圣克鲁斯生物技术有限公司(圣克鲁斯,CA)。Anti-phosphorylated Akt (P-Akt) anti-pan Akt (T-Akt) Anti-phosphorylated p38增殖蛋白激酶(p38激酶地图),和Anti-phosphorylated c-Jun n端激酶(物)抗体来自细胞信号技术(丹弗斯,MA)。Rashmi博士提供的O4抗体请邦萨尔(康涅狄格大学,斯托尔斯,CT)。从σAnti-β-actin抗体。适当的二次抗体都是来自圣克鲁斯生物技术公司。
隔离和OLG祖细胞的文化。OLG祖细胞分离得到2 -抱Sprague-Dawley老鼠大脑使用Percoll梯度紧随其后的附着力差,消除小胶质细胞,如前面描述的(Sato-Bigbee et al ., 1999)。浮动OLGs镀在48-well板块(Falcon)或8-well室幻灯片(Nalge Nunc国际Naperville, IL)涂上12.5μl /减少生长因子人工基底膜。定义的细胞保持在化学介质(CDM)[杜尔贝科修改鹰的介质(DMEM)火腿F-12介质(1:1;表达载体,宏伟的岛,纽约)补充1毫克/毫升脂肪无酸的牛血清白蛋白,50μg / ml转铁蛋白,胰岛素5μg /毫升、30 nM亚硒酸钠,0.11毫克/毫升丙酮酸钠,10海里生物素,20 nM黄体酮,100μM腐胺,和15 nM三碘甲状腺氨酸)。文化准备从这些细胞不成熟OLG祖细胞组成的双相或拥有一些简单的流程和沾A2B5 / O4抗体(Sato-Bigbee et al ., 1999)。Astroglial污染这些文化,作为评估神经胶质原纤维酸性蛋白染色,不到5%。动物使用和隔离OLGs依法进行了实验动物资源研究所(1996年批准的)和弗吉尼亚联邦大学动物保健和使用委员会。
小胶质Microglia-Conditioned媒体的文化和准备。后小胶质文化是从7-day-old老鼠的大脑准备上述方法OLG祖细胞的隔离。Percoll梯度后,包含OLGs和小胶质细胞的细胞悬液受到附着力差20分钟。坚定的小胶质细胞附着在板的底部在含2%胎牛血清的DMEM培养。microglia-conditioned介质制备报道之前彭日成et al。(2000年)。为此,文化越来越融合与PBS洗3次,然后孵化CDM或CDM 5μg /毫升有限合伙人。48小时后,中收集0.45 -μm注射器过滤器,过滤整除,直到使用存储在-20°C。
治疗FTY720或FTY720-P。后1天在文化、OLG祖细胞孵化了不同时期在DMEM-Ham F-12介质有或没有FTY720或(年代)-FTY720-P。细胞免疫印迹分析被加工或末端转移酶的dUTP缺口末端标记(TUNEL)分析如下所述。在实验来评估不同的蛋白激酶的作用,这些细胞被preincubated 10分钟在以下特定激酶抑制剂:PD98059 (MEK抑制剂,50μM) LY294002 (PI3K抑制剂,30μM),或DMS (SphK抑制剂,5μM)。文化是培养15分钟的要么1μM FTY720激酶抑制剂或两者的结合。TUNEL检测,添加抑制剂添加FTY720前10分钟。在这些实验中,PD98059 10μM的浓度。控制媒体包含同样体积的车辆的抑制剂是溶解(二甲亚砜LY294002 PD98059和4毫克/毫升牛血清白蛋白为DMS)。抑制剂浓度与之前使用的协议我们和其他人在OLGs专门抑制这些激酶(Sato-Bigbee et al ., 1999;崔et al ., 2006)。
FTY720诱发ERK1/2 OLG祖细胞和一种蛋白激酶磷酸化。A和C,细胞被孵化的DMEM-Ham F-12介质有或没有0.1或1μM FTY720。B和D,细胞培养不同时间1μM FTY720。P-ERK1/2和P-Akt水平测定免疫印迹分析。β-Actin水平作为加载控制。免疫印迹实验数据对应于代表。结果被表示为一个百分比的控制(0μM FTY720 a和C;0 B和D)和代表均值±S.E.M.从五个独立实验一式三份。*,p< 0.01;* *,p< 0.002。
免疫印迹分析。OLG祖文化包含相同数量的细胞每口井75年细胞溶解μl 60毫米Tris-HCl缓冲区(pH值6.8)包含10%甘油、2% SDS, 2-mercaptoethanol 5%。样品(15μl)受到SDS-polyacrylamide在12%的丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质electrotransferred硝基。膜被进行免疫印迹分析之前报道(赛et al ., 2005),小的修改。非特异性抗体绑定的屁股被孵化的10毫米Na2HPO4氯化钠、氯化钾2.7毫米和137毫米,pH值7.4,(PBS)包含3%的脱脂奶粉和0.05%的渐变20(屏蔽解决方案)在室温下1 h。屁股在一夜之间被孵化与anti-P-ERK1/2(稀释1:1000),抗体能够与第42页,p44 erk在酪氨酸磷酸化204年或anti-P-Akt(稀释1:1000),抗体识别一种蛋白激酶磷酸化时爵士473年在c端监管领域。Anti-T-ERK1/2(稀释1:1000)和anti-T-Akt(稀释1:1000)抗体被用来检测总ERK1/2和总Akt的水平。与anti-β-actinβ-Actin水平检测抗体(稀释1:20 00)被用作加载控制。与PBS广泛冲洗后,印迹孵化了30分钟在屏蔽解决方案,其次是孵化与适当的辣根peroxidase-conjugated二级3 h。抗体都是稀释的抗体阻断缓冲区。两个5分钟后冲洗在PBS含有0.05%渐变20和四个10分钟冲洗在PBS,免疫反应性的乐队是由化学发光检测与西方SuperSignal硬脑膜试剂(皮尔斯化学,罗克福德,IL)。免疫反应性的蛋白质的相对数量在每一个乐队是由x射线扫描光密度分析电影使用美国国立卫生研究院的形象J程序。量化后的乐队,值除以β-actin正确加载水平差异。
凋亡细胞的检测。与4%的多聚甲醛固定细胞后在室温下1 h,凋亡OLG祖细胞的数量取决于检测DNA碎片使用TUNEL分析(原位细胞死亡检测设备;罗氏诊断,印第安纳波利斯,先前报道的)(赛et al ., 2005)。Fluorescein-labeled核苷酸结合3′羟基末端被孵化可视化与辣根peroxidase-conjugated anti-fluorescein抗体。细胞被对待diaminobenzidine (metal-enhanced民建联衬底设备;罗氏诊断)检测过氧化物酶活动,其次是光显微镜检查。对于每一个条件,至少20视觉领域包含大约200个细胞都进行了分析。
(3H]胸腺嘧啶核苷掺入。隔离后,OLG祖细胞被镀在48-well板块之前涂上12.5μl /减少生长因子人工基底膜和保持在清洁发展机制。第二天,中取代了CDM包含1μCi /毫升(3H]胸苷(75 ci /更易;Amersham生物科学,皮斯卡塔韦,NJ) 1的存在与否μM FTY720。经过18 h,冰冷的PBS的文化清洗三次,其次是孵化用20%三氯乙酸1到2 h在4°C。四洗后用5%三氯乙酸,细胞被孵化可溶性70%甲酸在37°C 1 h。整除被用来确定放射性的液体闪烁计数。
免疫细胞化学。OLG祖细胞在8-well镀室幻灯片(Nalge Nunc国际)涂层与12.5μl /减少生长因子在CDM人工基底膜和维护。第二天,中独自CDM取代或补充1μM FTY720, 50 ng / ml NT-3,或两者的结合FTY720 NT-3。每天中取代了。5天,在4%多聚甲醛固定细胞,免疫细胞化学进行了报道之前(Sato-Bigbee et al ., 1999)。非特异性抗体绑定被孵化的细胞1 h PBS中含5%脱脂奶粉,0.05%渐变20,0.5%正常山羊血清(屏蔽解决方案)。O4抗体的细胞在一夜之间被孵化(稀释1:3)屏蔽解决方案。在PBS几个洗后,30分钟的细胞被孵化屏蔽解决方案和2 h和Alexa 488 -共轭anti-mouse IgM(稀释摘要)。分析了文化使用尼康Eclipse 800荧光显微镜。
ERK1/2和FTY720涉及MEK引起的一种蛋白激酶磷酸化,PI3K-dependent通路。细胞治疗有或没有1μM FTY720 PD98059的存在与否(MEKi) (A和C)或LY294002 (PI3Ki) (B和D),所述材料和方法。P-ERK1/2和P-Akt水平测定免疫印迹分析。结果被表示为一个百分比的控制(DMEM-Ham独自F-12介质)和代表均值±S.E.M.从三个独立的实验一式三份。*,p< 0.05;* *,p< 0.005;* * *,p< 0.0001。
ERK1/2 FTY720-dependent感应和一种蛋白激酶磷酸化由DMS抑制。细胞治疗有或没有1μM FTY720 5μM DMS的存在与否。P-ERK1/2 (A)和P-Akt (B)水平测定免疫印迹分析。结果被表示为一个百分比的控制(DMEM-Ham独自F-12介质)和代表均值±S.E.M.从四个独立实验一式三份。*,p< 0.05;* *,p< 0.02;* * *,p< 0.01。
统计分析。统计分析是由单向方差分析和一个临时Tukey-Kramer测试(GraphPad棱镜;GraphPad软件公司,圣地亚哥,CA)。时被认为是具有统计学意义的差异p< 0.05。
ERK1/2 OLG祖细胞和一种蛋白激酶磷酸化也诱导合成(年代)-FTY720-P。A和C,细胞被孵化的DMEM-Ham F-12介质有或没有0.1μM或1μM (年代)-FTY720-P描述下材料和方法。B和D细胞孵化与0.1μM(不同时间年代)-FTY720-P。P-ERK1/2和P-Akt水平测定免疫印迹分析。结果表示为百分比的控制(0μM (年代A和C) -FTY720-P;0 B和D)和对应的时间均值±S.E.M.从四个独立实验一式三份。*,p< 0.05;* *,p< 0.005;* * *,p< 0.001。E,细胞治疗有或没有1μM (年代的存在与否)-FTY720-P 5μM DMS。P-ERK1/2水平表示为一个百分比的控制(DMEM-Ham独自F-12介质)和代表均值±S.E.M.从两个独立的实验中表现一式三份。*,p< 0.001。
结果
治疗和FTY720 OLG祖细胞导致增加ERK1/2和Akt的磷酸化。因为我们之前发现的S1P信号的刺激中扮演着关键角色OLG祖生存NT-3 (赛et al ., 2005)和FTY720鉴于大多数行动是由S1P受体(Brinkmann林奇,2002感兴趣的),它是检查FTY720对OLG祖细胞的影响。类似于S1P (飞驒et al ., 1999;赛et al ., 2005),FTY720激活ERK1/2治疗(图1,A和B)。的浓度显著影响被观察到1μM (图1一个在15 min()和最大图1 b)。FTY720还一种蛋白激酶的磷酸化在类似的剂量和时间的方式(图1,C和D)。然而,治疗FTY720没有产生任何重大的变化总ERK或总Akt的水平。此外,FTY720没有激活p38 MAP激酶或物,确定与phosphospecific抗体(数据未显示)。
ERK1/2的刺激而引起的一种蛋白激酶磷酸化FTY720显著降低了MEK抑制剂PD98059 (图2 A和C)以及由PI3K抑制剂LY294002 (图2,B和D)。因此,FTY720对OLG祖细胞有直接行动激活MEK / ERK1/2和PI3K / Akt通路,影响似乎涉及信号级联之间的交互。
ERK1/2 FTY720-Dependent感应和一种蛋白激酶磷酸化需要SphK活动和模仿的合成(年代)-FTY720-P。几项研究已经涉及FTY720-P S1P模拟,作为生物活性形式负责FTY720效果(千叶et al ., 2006)。然而,最近的报告表明,FTY720还行为独立于其磷酸化SphKs和需要S1P受体(佩恩et al ., 2007)。这些观察结果提出的问题是否FTY720行动SphK OLG祖细胞需要活动的同工酶。为了解决这个问题,我们首先研究FTY720刺激ERK1/2的能力和一种蛋白激酶磷酸化细胞治疗DMS, SphK1和SphK2的抑制剂。图3中,A和B显示,与DMS coincubation废除了FTY720-dependent刺激ERK1/2和一种蛋白激酶磷酸化,建议由SphK FTY720磷酸化的要求。支持这一观点,我们下一个检查是否影响OLG FTY720的祖细胞被磷酸化形式模仿,FTY720-P。这些实验进行了使用活性(年代)对映体FTY720-P,体内磷酸化FTY720产品(艾伯特et al ., 2005)。孵化的OLG祖细胞(年代)-FTY720-P导致强劲增加ERK1/2和一种蛋白激酶的磷酸化(图4)。这种刺激,发生在一个较低的药物浓度比所需FTY720 (图4 A和C)。此外,FTY720对动力学(年代)-FTY720-P行动表明,(年代)-FTY720-P诱发ERK1/2和Akt激活速度比其nonphosphorylated形式,显著影响被观察到在5分钟(图4 B和D)。这些发现表明,FTY720行动OLG祖细胞由SphK之前其磷酸化。在协议中,激活的ERK1/2 (年代)-FTY720-P没有受到DMS (图4 e),充实磷酸化的概念需要FTY720 OLG祖细胞的行为。
FTY720刺激OLG祖细胞的生存。文化孕育了22 h DMEM-Ham F-12中有或没有1μM FTY720。DNA碎片被TUNEL分析评估。,图代表的数量TUNEL-positive细胞占总细胞数为每个视野。显微图显示领域的代表。至少20视觉领域进行了分析。*,p< 0.001。B、文化孕育了22 h DMEM-Ham F-12中单独或补充1μM FTY720 PI3K抑制剂的存在与否LY294002(30μM)或MEK抑制剂PD98059(10μM)。DNA碎片被TUNEL分析评估。图代表的数量TUNEL-positive细胞占总细胞数的每个视野。*,p< 0.001。C,细胞增殖是评估3H]胸腺嘧啶核苷掺入所描述的材料和方法。文化是孵化18 h在CDM的存在与否μM FTY720。结果代表意味着±S.E.M.从两个独立的实验一式三份。
FTY720块细胞凋亡引起的OLG祖细胞生长因子不足。ERK1/2和Akt都是参与调节OLG生存(it et al ., 2000;弗拉戈索et al ., 2004;崔et al ., 2006)。因此,发现FTY720诱发ERK1/2和一种蛋白激酶磷酸化使我们调查可能影响OLG祖细胞的生存。为此,生长因子的细胞培养受到剥夺,条件是凋亡OLG祖细胞(赛et al ., 2005)和可能是特别重要的在成人组织生长因子水平与发展中中枢神经系统相比显著降低。被TUNEL染色,隔夜孵化DMEM-Ham F-12媒介单独导致大约50%的细胞发生凋亡细胞死亡(图5)。然而,凋亡细胞的数量与FTY720对治疗显著降低,表明这种药确实有直接的生存影响OLG祖细胞。这种效应真正反映出在活细胞的百分比变化(3H]胸腺嘧啶核苷掺入实验表明,FTY720并不影响OLG祖细胞的增殖(图5度)。
FTY720对OLG祖细胞的凋亡作用被抑制PI3K和MEK信号。因为FTY720刺激ERK1/2和一种蛋白激酶磷酸化,然后我们检查的程度这两个蛋白激酶参与调停FTY720对OLG生存的影响。为此,FTY720阻止细胞凋亡研究的能力在文化ERK1/2和Akt信号被抑制的上游活化剂MEK和PI3K。观察过,FTY720保护细胞生长因子不足。然而,这种效应被cotreatment消除文化PD98059和LY294002 (图5 b),这表明ERK1/2和FTY720需要一种蛋白激酶信号刺激OLG祖细胞的生存。
FTY720 NT-3配合刺激OLG生存和分化。NT-3被刺激的生存OLGs并可能发挥重要作用在中枢神经系统损伤后髓鞘再生和髓鞘脱失(巴尔et al ., 1993;McTigue et al ., 1998;琼et al ., 2003;赛et al ., 2005)。我们曾发现NT-3刺激OLG祖细胞的生存机制,涉及S1P-dependent通路的激活(赛et al ., 2005)。因此,我们下一个检查NT-3和FTY720能否配合刺激OLG祖细胞的生存。文化接受和FTY720 NT-3显示凋亡细胞数量显著减少(15%),这是低于观察比例仅在文化这两种处理(图6)。有趣的是,FTY720似乎逮捕OLG祖细胞的分化,影响与NT-3 cotreatment克服的。所示图7、文化对待FTY720仅用一个简单的双相形态主要是由细胞不成熟OLGs的特征。另一方面,大多数的细胞,同时表现出FTY720和NT-3复杂和分支过程,一个形态的成熟OLGs说明。,这些观察结果表明,FTY720和NT-3能有效地促进OLGs生存和分化。
FTY720保护OLG祖细胞从细胞因子引起的细胞死亡和小胶质激活。死亡的OLGs脱髓鞘疾病,如女士也被认为是显著增加的炎性细胞因子如TNF-α和IFN-γ或自由基氧化应激的物种是由活化的小胶质细胞(McQualter和伯纳德,2007年)。事实上,TNF-α和IFN-γ显著诱导细胞凋亡OLG祖细胞(图8)。重要的是,FTY720有效保护细胞免受有害的行动的两个细胞因子。此外,与之前的报道相一致(彭日成et al ., 2000),治疗OLG祖细胞条件媒体LPS-activated诱导小胶质细胞大量凋亡细胞死亡(图8 b)。FTY720还保护了小胶质激活(OLG祖细胞从这些有害的行动图8 b)。,这些观察结果表明,FTY720可保护OLGs从许多的因素涉及女士的损耗。
FTY720 NT-3合作,促进OLG祖生存。文化孕育了22 h DMEM-Ham F-12媒介(控制),DMEM-Ham F-12介质与1μM FTY720 (FTY720) DMEM-Ham F-12介质的50 ng / ml NT-3 (NT-3),或DMEM-Ham F-12介质1μM FTY720和50 ng / ml NT-3 (FTY720 + NT-3)。24小时后,DNA碎片被TUNEL分析评估表示下材料和方法。图代表的数量TUNEL-positive细胞占总细胞数的每个视野。*,p< 0.001。
讨论
女士是一种慢性退行性疾病,中枢神经系统脱髓鞘病变被认为是直接与炎症过程,涉及相关巨噬细胞的激活和招聘,小胶质细胞和T淋巴细胞(Lucchinetti et al ., 2005)。出于这个原因,大多数目前的治疗包括抗炎药的使用。FTY720是展览承诺使用的最新的免疫调制剂治疗MS (卡珀斯et al ., 2006)。我们的研究结果表明,独立于其免疫抑制和抗炎功能,FTY720还可以产生有益的影响由于女士OLGs直接行动。重要的是,这些影响发生在FTY720浓度,根据最近的药代动力学研究组织分布(Meno-Tetang et al ., 2006),远FTY720内水平达到口服给药和静脉注射后在大脑管理。
NT-3抵消OLG祖成熟FTY720引起的抑制。文化培养5天在CDM(控制),CDM 1μM FTY720 (FTY720),与50 ng / ml NT-3 CDM (NT-3),或与1μM CDM FTY720和50 ng / ml NT-3 (FTY720 + NT-3)。和O4抗体固定后,细胞被应用。
我们发现FTY720保护培养OLG祖细胞凋亡细胞死亡,一个动作之前激活的MEK / ERK1/2和PI3K / Akt信号通路。观察的能力FTY720诱导ERK1/2 SphK抑制剂和一种蛋白激酶磷酸化废除的DMS表明FTY720行动OLGs SphK取决于其磷酸化的同工酶,最有可能SphK2 (Zemann et al ., 2006)。
ERK1/2和PI3K / Akt信号通路促进OLG涉及生存在不同条件下(it et al ., 2000;弗拉戈索et al ., 2004;崔et al ., 2006)。我们发现FTY720刺激这些通路OLG祖细胞的机制似乎需要两种信号级联之间的串音。结果表明,FTY720-dependent涉及的一种蛋白激酶磷酸化其经典激活PI3K以及MEK-dependent途径。同时,PI3K和MEK-dependent通路被FTY720 ERK1/2磷酸化诱导所需。PI3K / Akt之间密切的相互依存和MEK / ERK1/2信号通路也被报道在其他细胞类型。ERK1/2的关键作用Akt激活了UVB照射,有丝分裂原的情况,包括ERK1/2-dependent磷酸化和压力激发了蛋白激酶1 (野村证券(Nomura) et al ., 2001)。另一个这样的例子在Akt激活诱导的氧化应激,这被证明需要ERK1/2-dependent p66shc适配器蛋白质的磷酸化(胡锦涛等人。,2005年)。
重要的是要注意,在OLGs FTY720-P对ERK活化的影响似乎依赖于这些细胞的发育阶段,在最近的一份报告中未能发现ERK激活形态成熟OLGs (Osinde et al ., 2007)。此外,引发的信号通路FTY720似乎也表现出细胞特异性,因为以前的研究显示在T淋巴细胞激活p38 MAP激酶和物没有ERK刺激(松田et al ., 1999)。相反,我们并没有发现p38 MAP激酶的活化和物OLG祖细胞(数据没有显示)。
本研究进一步表明,FTY720保护OLG祖细胞活化的小胶质细胞的有害行为以及炎性细胞因子TNF-αIFN-γ,所有这一切都牵连到女士的发病机理(McQualter和伯纳德,2007年)。以前的研究(弗拉戈索et al ., 2004)显示ERK对凋亡细胞死亡有保护作用的OLGs活性氧引起的,是由活化的小胶质细胞(块et al ., 2007)。Akt可以起到至关重要的作用在OLG祖细胞的胰岛素样生长factor-1-mediated保护TNF-α(诱导细胞凋亡彭日成et al ., 2007)。因此,它很容易推测ERK和/或Akt通路可能参与FTY720-mediated保护OLG祖细胞与活化的小胶质细胞和炎性细胞因子。
的直接保护作用的可能性FTY720对OLGs尤为重要,因为不同的研究发现,与髓鞘和轴突退化(损失特拉普et al ., 1999(女士),OLG死亡的一个特征Barnett Prineas, 2004;Lucchinetti et al ., 2004)。此外,分析早期病变显示OLG女士死亡与很少或没有浸润淋巴细胞或巨噬细胞,提高的可能性,至少在一些病人,OLG死亡可能是一个女士的主要原因(Barnett Prineas, 2004)。
因此,OLG死亡是否引起女士的结果仍然是有争议的,但它现在清楚的是,这些细胞的损失是一个主要组件的疾病。发现FTY720能够刺激OLG祖细胞的生存非常重要,因为这些细胞remyelination过程中扮演着重要的角色代替了成熟OLG池(Keirstead布莱克莫尔,1999;赵et al ., 2005)。
FTY720保护OLG祖细胞和小胶质细胞因子激活诱导细胞凋亡。,OLG祖细胞在eight-well镀室幻灯片之前涂上12.5μl /减少生长因子人工基底膜和维护在清洁发展机制。第二天,中独自CDM取代或补充1μM FTY720, 100 ng / ml TNF-α,100 ng / ml IFN-γ,1μM FTY720 + 100 ng / ml TNF-α,或1μM FTY720 + 100 ng / ml IFN-γ。22 h后,细胞凋亡被TUNEL分析确定。图代表的数量TUNEL-positive细胞占总细胞数的每个视野。*,p< 0.01;* *,p< 0.001。一夜之间,B, OLG祖细胞被孤立和维护清洁发展机制。第二天,媒介也换成microglia-conditioned介质(MCM), LPS-treated microglia-conditioned介质(MCM-LPS), MCM 1μM FTY720 (MCM + FTY720),或与1 MCM-LPSμM FTY720 (LPS-MCM + FTY720)。48小时后,细胞被TUNEL检测分析。*,p< 0.001。
还应该认为FTY720可能影响remyelination影响其他细胞的中枢神经系统。在这方面,它最近被证明(年代)-FTY720-P对培养的星形胶质细胞有直接影响,刺激他们的迁移(Mullershausen et al ., 2007)和ERK的磷酸化(Osinde et al ., 2007通过S1P受体)。
目前发现OLG祖细胞,加上FTY720-P行动星形胶质细胞的观察,表明,机制的有利影响FTY720女士更复杂的比之前的猜测。一方面,FTY720的疗效可能源于其诱导T淋巴细胞封存能力(千叶et al ., 1998;Brinkmann林奇,2002;曼荼罗et al ., 2002),干扰树突状细胞功能(局域网et al ., 2005)和胞质磷脂酶的抑制2和类二十烷酸生产(佩恩et al ., 2007)。另一方面,除了这些重要的免疫调节作用,在女士也反映了一个积极的结果直接行动FTY720对中枢神经系统的不同细胞群,包括细胞内oligodendroglial和星形血统。我们的研究结果表明,FTY720施加直接凋亡保护作用OLG祖池,这些活动的高潮可能失去成熟OLGs和补给,因此,促进的过程remyelination女士然而,这项研究的一个重要发现是,积极影响的FTY720 OLG祖细胞的生存与明显抑制他们的成熟,由NT-3中和产生影响。这个观察表明,FTY720女士治疗应包括如NT-3 remyelinating代理的使用。这种治疗方法将确保保护现有OLG祖池对immunemediated侮辱以及刺激remyelination通过提高这些细胞的分化。
脚注
这项工作受到了国家多发性硬化症协会授予RG3432A2/2 (C.S.-B。)和部分由美国国立卫生研究院拨款GM43880(轮)和格兰特HL083187 (R.B.)。
文章、出版日期和引文信息可以发现http://jpet.aspetjournals.org。
doi: 10.1124 / jpet.107.123927。
缩写:女士,多发性硬化;中枢神经系统,中枢神经系统;OLG,少突细胞;FTY720 2-amino-2 - [2 - (4-octylphenyl)乙基]1、探索;实验性自身免疫性脑脊髓炎运算单元,;IFN-γinterferon-γ;SphK,鞘氨醇激酶;SphK2 SphK 2型;FTY720-P (年代)-FTY720-phosphate;S1P sphingosine-1-phosphate;NT-3 neurotrophin-3;ERK1/2,细胞外信号调节激酶1/2;一种蛋白激酶,蛋白激酶B;有限合伙人,脂多糖;肿瘤坏死factor-αTNF-α;PI3K phosphoinositide-3激酶;(LY294002 2) - 4-morpholinyl 8-phenyl-4H1-benzopyran-4-one;MEK,有丝分裂原细胞外信号调节激酶激酶;PD98059 2′-amino-3′酸酯;DMS,N, N-dimethylsphingosine;P,磷酸化;T,总;p38激酶地图,p38增殖蛋白激酶;物,c-Jun n端激酶;清洁发展机制,定义化学介质;DMEM,杜尔贝科修改鹰的媒介;TUNEL,末端转移酶的dUTP缺口末端标记;PBS,磷酸盐。
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- 收到了2007年4月3日。
- 接受2007年8月27日。
- 美国社会的药理学和实验性疗法
![FTY720 stimulates survival of the OLG progenitors. Cultures were incubated for 22 h in DMEM-Ham's F-12 medium with or without 1 μM FTY720. DNA fragmentation was assessed by TUNEL assay. A, the graph represents the number of TUNEL-positive cells as a percentage of total cells counted for each visual field. The micrographs show representative fields. At least 20 visual fields were analyzed. *, p < 0.001. B, cultures were incubated for 22 h in DMEM-Ham's F-12 medium alone or supplemented with 1 μM FTY720 in the presence or absence of the PI3K inhibitor LY294002 (30 μM) or the MEK inhibitor PD98059 (10 μM). DNA fragmentation was assessed by a TUNEL assay. The graph represents the number of TUNEL-positive cells as a percentage of total cells counted for each visual field. *, p < 0.001. C, cellular proliferation was assessed by [3H]thymidine incorporation as described under Materials and Methods. Cultures were incubated for 18 h in CDM in the presence or absence of 1 μM FTY720. The results represent the means ± S.E.M. from two independent experiments done in triplicate.](https://jpet.aspetjournals.org/content/jpet/323/2/626/F5.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1){kind=link}
