文摘
客观的确定的遗传基础bottom-of-sulcus发育不良(BOSD),这是一个高度焦点和致癫痫的皮质畸形的成像、电生理学的,和病理异常是沟的底部最大,逐渐减少正常旋转的皇冠。
方法目标板深度测序(> 500×)进行配对血液和脑源性基因组DNA从20耐药局灶性癫痫患者和BOSD操作。组织病理学评估使用免疫组织化学。
结果Brain-specific致病性体细胞变异被发现在6例和杂合的致病性遗传变异被发现在2。体细胞变异被发现MTOR和生殖系变异中确定DEPDC5和NPRL3。两个患者体细胞MTOR突变负载较高的变异显示突变梯度,沟的底部与旋转的皇冠。免疫组织化学显示大量的畸形神经元和气球细胞在沟的底部而不是在旋转的皇冠或相邻的脑回。
结论BOSD与mTOR通路失调和股票常见的遗传病因和致病机制与其他形式的焦点和半球皮质发育不良,建议这些疾病基因的连续体。
术语表
- BOSD=
- bottom-of-sulcus发育不良;
- ddPCR=
- 数字PCR滴;
- ECoG=
- electrocorticography;
- FCD=
- 局灶性皮质发育不良;
- FCDII=
- II型局灶性皮质发育不良;
- FFPE=
- formalin-fixed石蜡包埋;
- HME=
- hemimegalencephaly
局灶性皮质发育不良(FCD)是一种耐药局灶性癫痫的主要原因,II型FCD (FCDII)是最常见的病理类型。1汇集一起的证据显示在FCD mTOR通路失调的参与,包括与致病性体细胞变异识别基因MTOR,TSC1,TSC2和致病性遗传变异中确定DEPDC5,NPRL2,NPRL3。2他2机制中描述的几个病人,生殖系体细胞变异DEPDC5导致biallelic失活的基因。3,- - - - - -,5
大脑畸形与mTOR通路失调相关的频谱范围从小型fcd hemimegalencephaly (HME)。研究体细胞突变负载在不同形式的脑部畸形显示,突变负载与大脑畸形的程度呈正相关。6这表明连续的皮质发育不良,与更广泛的病理发生体细胞突变时在皮质的发展。7Bottom-of-sulcus发育不良(BOSD)是在温和的MRI-positive FCD年底,发育异常的功能成像和组织病理学最大底部的沟,逐渐减少正常旋转的皇冠。8,9
BOSD的遗传原因仍不完全理解。以前的研究报道生殖系DEPDC5和NPRL3变异在某些BOSD患者,10,- - - - - -,12但其他mTOR通路基因的参与是未知的。鉴于体细胞镶嵌性的作用在大FCD和HME,我们假设BOSD也可能致病体细胞变异的结果。我们报告基因分析BOSD的20名患者使用深度测序的血液和脑源性gDNA目标。
方法
标准协议的审批、登记和病人同意
本研究是人类研究伦理委员会批准的皇家儿童医院29077年(ID)和书面知情同意获得参与者或监护人。
临床、影像和手术的细节
临床研究结果提出了详细描述表1。所有20个患者耐药局灶性癫痫,癫痫手术在皇家儿童医院,墨尔本,澳大利亚,2004年和2017年之间。都有FCDII经病理组织切片证实。他们是典型的BOSD成像特性,8发育不良仅限于一个沟,沟的底部最大异常,与皮质增厚,灰白色模糊,信号变化,通常transmantle符号(图1)。癫痫发作是0.3和14岁之间,所有患者智力正常。五个病人(患者8、9、10、14和17)有癫痫家族史的第一,第二,或第三等级的亲戚,4人家庭成员有局灶性癫痫。癫痫是一个焦点类型在18/20的病人,和发作或发作的脑电图显示在所有患者单焦痫性活动。BOSDs明显和术前MRI在报道7例(35%),但在MRI和微妙的不报道最初在13个,检测被摄影和专家辅助MRI检查。BOSDs的位置在16日额顶叶在3日在1和脑岛,在左边的12。
日冕t2加权MRI表现为3.0 t显示bottom-of-sulcus发育不良3代表病人(箭头所指)。典型的成像特性包括皮层增厚,模糊的灰白色物质结,皮层下沟的底部信号,增加和transmantle迹象。我们发现了一个躯体MTOR变体在病人2 (A。和A.b),生殖系杂合的DEPDC5变异的病人7 (B。和反方向),生殖系杂合的NPRL3变异患者8 (C。一个和C.b)。
癫痫手术进行了1.2和18.0岁之间。一个病人接受了持续的癫痫和残余发育不良再次手术。所有手术都做1阶段形象指导和术中electrocorticography (ECoG)在全身麻醉下。术中ECoG显示连续的、周期性的或频繁的棘波活动只记录或最大限度地从底部发育异常的沟的深度研究电极在16/18的病人。术后结果进行评估基于国际抗癫痫联盟分类。1316个病人控制发作(80%),15个抗癫痫药物,随着时间的推移,参与1.8 - -14.6年(平均4.8年)。
标本收集和基因组DNA的准备
收集标本进行基因检测的手术。脑组织被存储为用来进行标本和档案formalin-fixed石蜡包埋组织块(FFPE)。大脑标本的解剖位置被标注在图或手术照片,专门记录样本是否来自于旋转的皇冠,覆盖正常皮层,发育不良的沟的顶部或底部的发育异常的沟。从全血基因组DNA提取和冷冻脑组织NucleoBond CB工具包(Machery-Nagel、Duren、德国;740509)和prepIT-C2D基因组DNA MiniPrep工具包(DNA Genotek,渥太华,加拿大;分别PT-C2D-50)。
组织病理学和免疫染色
组织病理学的诊断评估进行切除的脑组织神经病理学家利用标准光学显微镜和苏木精和伊红染色。疣状随后执行在所有患者除了研究实验室11和12由于组织限制。平行分析2控制皮质组织样本进行:1 FCD I型和1尸检脑标本来源于半球的单边polymicrogyria患者的影响。FFPE组织部分进行脱蜡、水化和抗原检索使用citrate-based抗原暴露的解决方案(向量实验室,伯林盖姆,CA;3300);冷冻组织切片处理没有脱蜡,补液或抗原检索。FFPE 10μm或冷冻组织切片厚度孵化一夜之间在4°C anti-phospho-S6核糖体蛋白(Ser235/236)抗体(1:10 0;细胞信号,贝弗利,马;2211)或anti-neurofilament smi - 311 r抗体(1:1,000;圣地亚哥BioLegend CA; SMI-311R) and then incubated with biotinylated anti-rabbit or anti-mouse immunoglobulin G secondary antibody (1:1,000; Vector Laboratories; BA-1100) for 1 hour at room temperature. Tissue sections were rinsed and incubated with avidin-biotin complex solution (Vector Laboratories; PK-4000) for 1 hour at room temperature. Visualization of immunoreactivity was performed using the DAB Substrate Kit (Vector Laboratories; SK-4100) according to manufacturer's instructions.
HaloPlex海关针对面板测序
自定义HaloPlex面板设计使用SureDesign软件(安捷伦,圣克拉拉,CA)。这个面板有针对性的331个基因,表示已知的基因与大脑畸形,潜在的互动合作伙伴和相关通路基因以前被字符串分析和文献挖掘。14该委员会预计捕获目标地区1.334 Mbp的99.86%。Paired-end编码库生成从50 ng输入gDNA使用自定义HaloPlex目标浓缩工具包(安捷伦)。我们执行2×150个基点paired-end测序使用NextSeq (Illumina公司,圣地亚哥,CA),生成> 500×意味着深度测序数据样本。多路分解执行bcl2fastq2工具和去复用fastq文件进行了分析使用SureCall软件(安捷伦)。变体致病性评估根据美国大学医学遗传学和基因组学标准。15,16
液滴数字PCR (ddPCR)
验证低等位基因频率体细胞变异被目标排序,我们执行ddPCR血液和脑源性gDNA样本配对。我们使用自定义TaqMan SNP基因分型试验(热费希尔科学、沃尔瑟姆,MA)根据制造商的协议。简而言之,2×10μL ddPCR Supermix为探针(没有dUTP;Bio-Rad[大力神,CA);1863024),0.5μL 40×ddPCR SNP检测试验(具体每个变体),和gDNA结合在一个20μL反应混合物和执行自动液滴生成qx - 200 (Bio-Rad)。PCR进行使用C1000触摸周期计(Bio-Rad)以下循环条件:95°C 10分钟1周期,紧随其后的是40周期在94°C 30秒和60秒60°C,在最后一个周期98°C 10分钟。样品进行了分析使用qx - 200数字板读者和QuantaSoft软件(Bio-Rad)。
数据可用性
匿名数据共享的要求从任何合格的调查员与参与者一致同意。
结果
免疫组织化学结果
诊断组织病理学显示FCDIIA 7病人和FCDIIB 13 (表1和图2中,A和B)。疣状神经丝smi - 311显示明显肿大变形神经元(图2 c)。强烈的免疫反应性对p-S6在场所有18个BOSD标本测试(图2 d),但无论是2控制标本(图2中,E和F)。
基因的发现
我们确定致病性,brain-specific,体细胞变异MTOR在6 FCDIIB患者和一个致病性杂合的生殖系变异DEPDC5和NPRL3在2附加FCDIIA患者(表2)。病人与FCDIIANPRL3变体(病人8)之前报道了变体隔离11(个人III-4)。
所有的体细胞MTOR变异(NM_004958.3: c。6644 c > (p。年代2215Y], NM_004958.3:c.5930C>A [p.T1977K], and NM_004958.3:c.4376C>A [p.A1459D]) were independently validated using custom ddPCR assays, with estimated allele frequency similar to that determined by targeted sequencing (表2)。我们进行有针对性的在更大的深度测序(平均深度> 800×)但是没有发现体细胞变异的患者2 FCDIIA与致病性杂合的生殖系变异DEPDC5(NM_001242896.2: c。460_463dupGGCT [p.Y155Wfs*5]) andNPRL3(NM_001077350.2: c。137年5_1376dupAC [p.S460Pfs*20]).
3其他FCDIIB患者,我们确认单,杂合的,生殖系变异的不确定的意义TSC2(NM_000548.5: c。4660C>A [p.Q1554K],WDR59:NM_030581.4: c。2635C>T [p.R879*]) and绪(NM_019005.4: c。916G>A [p.G306R]). In one patient with FCDIIA, we identified 2 heterozygous germline variants of uncertain significance, inTSC2(NM_000548.5: c。29日32C>T [p.R978C]) andWDR59(NM_030581.4: c。1352C>T [p.T451I]) (表2)。两个病人(病人9 [TSC2 p。Q1554K]和病人10 [TSC2 p。R978年C/WDR59p。T451我]) reported a family history but additional samples were not available for segregation analyses.
4个患者体细胞MTOR变异,我们使用ddPCR量化体细胞突变负载在沟的底部和标本从一个单独的位置(图3),切除手术提供访问BOSD或延长切除下沟的边界。三个病人被移除的旋转的桂冠(患者1、3和5)和一个病人邻近皮层切除的病人(病人4)。1和5,我们观察到一个较低的突变负载在旋转的皇冠沟的底部相比,表明存在“突变梯度,”高突变负载的标本与大多数发育异常的组织(图4中,A和B)。另2例,体细胞变异中没有检测到旋转的皇冠(病人3)或邻皮质(病人4)(图4中,C和D)。检查病理沟的底部之间的差别和旋转的皇冠或邻皮质,我们执行p-S6疣状对大脑部分来自这些地区。在所有4例,异常的细胞类型,并有很强的p-S6免疫反应性被发现在丰富沟的底部。相比之下,我们观察到的异常细胞很少在旋转的皇冠的病人1和5,而没有发现异常细胞在患者3或旋转的皇冠邻皮质病人4。
冠状,轴向和矢状t1加权磁共振成像在3.0 t切除组织的显示位置。箭头指示的位置沟的底部标本和箭头指示的位置旋转的皇冠或相邻回标本。基因组DNA准备从脑组织与液滴分析数字PCR使用特定调查旨在确定变异等位基因(蓝色)或引用野生型等位基因(绿色)。黑点代表消极的水滴不含DNA扩增;橙色圆点代表液滴包含多个模板。在病人1 (A),躯体MTOR变体(c.6644C >)负载在沟的底部5.2%和0.7%在旋转的皇冠。formalin-fixed组织化学染色石蜡包埋(FFPE)大脑部分显示丰富的异常细胞在沟的底部但很少在旋转的皇冠。在病人5 (B),躯体MTOR变体(c.5930C >)负载在沟的底部2.9%和0.5%在旋转的皇冠。FFPE大脑部分显示丰富的异常细胞组织化学染色,在沟的底部但很少在旋转的皇冠。在病人3 (C),躯体MTOR变体(c.6644C >)负载在沟的底部4.8%但没有旋转的皇冠。疣状在冰冻的大脑部分显示丰富的异常细胞在沟的底部,但不旋转的皇冠。在病人4 (D),躯体MTOR变体(c.5930C >)负载在沟的底部5.8%但在邻皮质缺席。疣状FFPE大脑部分显示丰富的异常细胞在沟的底部而不是邻皮质。酒吧= 100μm规模。
讨论
而最近的研究已开始描绘一系列多样化的皮质发育不良的遗传基础,6,17没有特别BOSD患者群体的调查。一项研究发现生殖系DEPDC5变异在血液gDNA 3 BOSD患者,10和我们之前报道的生殖系NPRL3变体(病人8在这项研究)在一个病人。11最近,有针对性的测序研究gDNA源自切除患者脑组织5 BOSD确定生殖系DEPDC5在一个病人的变体。12除了生殖系变异DEPDC5和NPRL3,我们扩大的遗传景观BOSD证明低等位基因频率体细胞变异MTOR是一个条件的主要原因。这三个基因也被先前与FCDII和HME,确认BOSD是在同一个基因谱。
几个基因的研究FCD脑组织中分离出致病性体细胞变异MTOR。6,17,- - - - - -,21在这项研究中,我们确定了3之前报道和复发MTOR变异(p。T1977K, p。年代2215Y,p。一个1459D) in 6 patients. TheMTOR变体p。T1977年Kwas previously identified in 6 patients with FCD5,20.,22和HME 1,6p。年代2215Ywas reported in 11 patients with FCD5,6,17,19,21,22和HME 1,6和p。一个1459Dwas reported in 4 patients with FCD5,19,22和2。5,23以前的功能研究表明,氨基酸的变化在这些位置可能导致致病性hyperactivation mTOR的途径。23,24这些周期性的体细胞变异MTOR会导致频谱的表型,从高度局部病变如BOSD半球HME等畸形,可能由于遗传的时机的侮辱。在这个群,体细胞MTOR变体BOSD的占30%。这是符合最近的一个大型队列研究,报道致病性体细胞MTOR变异在32.3%的患者FCDII或。5
患者2例(1 - 5),我们显示的“体细胞突变梯度,即沟的底部表现出较高的突变负载而旋转的皇冠显示较低的突变负载。突变梯度的概念已经被提到在较大的皮质发育不良,先前的研究证据表明它与最大epileptogenicity的地区。3,4,17我们的研究表明,这样一个梯度可以确定即使在高度局部病变,突变负载的差异发现沟的底部与旋转的皇冠。此外,定性评估基于免疫组织化学显示大量的异常细胞的底部高沟相比,旋转的皇冠。这是符合先前的调查结果,异常细胞密度与高突变负载,体细胞变异主要是发现异常细胞类型。4,5我们的数据表明,在旋转的皇冠,减少数量的细胞港体细胞变异,从而导致低突变负载和神经影像学缺乏明显的异常。2其他病人(患者3和4),我们没有发现体细胞变异或异常细胞在旋转的皇冠和上覆正常皮层,进一步支持了这种观点,即BOSD主要是由体细胞变异引起的局部沟的底部的小病灶。
DEPDC5、NPRL2 NPRL3 GATOR1复杂形式,充当mTOR通路的抑制因子。几项研究已经报道杂合的生殖系GATOR1 FCD变体,5,10,11,17,22,25,- - - - - -,29日尽管底层机制生殖系突变会导致局部病变原因还不是很清楚。最近的报告提出的“两面夹攻”机制可能适用于某些情况下FCD。3,- - - - - -,5,22,25BOSD队列,2例有一个生殖系杂合的变体在GATOR1亚基(DEPDC5和NPRL3),但我们无法确定第二个相同基因的体细胞变异,即使深有针对性的测序。到目前为止,只有5患者体细胞第二支安打DEPDC5在FCD报道,3,- - - - - -,5,22,25突出的困难检测体细胞变异,这可能出现在非常低的频率在发育异常的组织由不同的细胞组成的。专业超深测序等方法,单细胞测序,或细胞类型特定的基因分析使用激光捕获显微解剖可能需要识别这些第二体细胞击中体细胞突变负载的影响皮层各不相同。3,4,17这些发现强调了需要确保地区最严重的畸形,包括高浓度的畸形神经元,选择进行体细胞突变分析。也有可能一个两面夹攻的机制可能出现的杂合突变是出现在两个不同mTOR通路的基因,虽然证明因果关系在这种情况下是很困难的。这种机制的一个潜在的例子最近被描述在一个病人。一个brain-specific体细胞MTOR变体和马赛克RPS6变体被确定,这双重打击2 mTOR通路基因被认为构成表型。30.这是未知的一个类似的机制是否也适用于FCD或BOSD。
到目前为止,所有在mTOR通路与FCDII功能相关的基因。2因此我们修改我们的筛选标准包含在这个途径不确定的意义影响基因的变异。这导致了识别患者4杂合的生殖系变异的不确定的意义TSC2(2×),WDR59,绪(患者9 - 12,表2)。虽然TSC2变异参与FCD,31日我们确定的生殖系变异这个基因出现不足以解释BOSD表型,当我们没有观察这些病人错构瘤通常与致病性生殖系相关联TSC2变体。WDR59和绪GATOR2复杂的组件,压制GATOR1复杂,32但GATOR2在大脑畸形的作用仍然是未知的。先前的研究FCD确认3小说错义变异WDR24和SEC13还GATOR2的编码组件复杂,但其致病性不能成立。29日值得注意的是,病人10生殖系变异TSC2(p.R978C)和WDR59(p.T451I),但目前尚不清楚这些变体各有有害的影响,结合时就足以导致BOSD。这些变异的潜在角色的不确定的意义值得进一步研究,例如通过功能研究在老鼠身上携带两个变体。30.
BOSD 8的情况下,我们无法检测致病变种或变型不确定的意义影响mTOR通路中的基因。缺乏对这些病人基因诊断可能是由于基因的变异或地区不被我们目标排序的方法或者询问,体细胞变异出席一个等位基因频率太低我们探测到的方法。鉴于mTOR失调就是明证免疫反应性对phospho-S6 18 BOSD标本中检测出所有测试,我们建议的负面情况下可能港基因变异影响mTOR通路,直接或间接。同样,最近的一项研究也报道p-S6 FCDII患者的免疫反应性和HME基因诊断。5
我们得出这样的结论:BOSD属于群mTORopathies扩张。诊断40%的速度在我们的研究中类似于其他皮质畸形的最近的研究,和大量的情况下仍然没有基因诊断。我们预计,诊断速度将增加,因为新基因发现和改进检测到低水平的应用体细胞变异的方法。超低的可能作用在MRI-negative焦mTOR通路基因的体细胞镶嵌性癫痫仍有待确定,但BOSD很可能不会最小的病变包括mTORopathy频谱。改进的理解BOSD的遗传基础和临床适用性FCD有直接的超微结构特征。我们观察到高突变负载与异常相关的核心地区发育异常的细胞密度BOSD可能影响手术管理通过支持高度集中切除术的方法旨在消除或去除病灶的高度突变致癫痫的组织在一个更大的畸形。积极的基因诊断也有助于解决复发风险告知遗传咨询。目前,fcd根据病理特点进行分类。33fcd遗传学认识的提高,未来的分类系统可能包括分子分类,可以帮助指导治疗方法包括手术和药物治疗。
研究资金
这项研究是由国家卫生和医学研究委员会(GNT1128933和GNT1161549)和默多克儿童研究所。额外的资金是由独立的研究所提供基础设施支持方案和维多利亚州政府运营的基础设施项目。支持R.J. levent墨尔本儿童临床科学家奖学金方案和P.J.洛克哈特文森特Chiodo基金会的支持。这项研究并没有参加。
信息披露
至此Lee S.E.M.斯蒂芬森,k教皇,g . Gillies w . Maixner e . Macdonald-Laurs D·麦格雷戈c·达奇·g·杰克逊,响亮的哈维报告没有披露。R.J. levent收到了来自国家卫生和医学研究委员会的资金支持(GNT1128933和GNT1161549)和墨尔本儿童临床科学家奖学金计划。P.J.洛克哈特收到了来自国家卫生和医学研究委员会的资金支持(GNT1128933和GNT1161549)和文森特Chiodo基础。去首页Neurology.org/N为充分披露。
附录的作者
脚注
去首页Neurology.org/N为充分披露。资金信息和披露认为作者相关的,如果有的话,年底提供这篇文章。
↵*这些作者的贡献同样这项工作。
- 收到了2020年2月6日。
- 接受的最终形式2020年6月3日。
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