文摘
摘要目的:检查stereologic AD-related病理学的估计和严重程度之间的关系的认知缺陷在大脑衰老。
背景:以前的研究报道实质性贡献的神经原纤维缠结(非功能性测试),淀粉样蛋白沉积,神经元损失痴呆的发展。然而,认知状态的预测基于nonstereologic量化这些措施导致了相互矛盾的结果。这样的研究测量密度,而不是绝对数字,大多数不考虑潜在的上述病理特征之间的相互作用在全球多元分析。
方法:在22个老年病例临床病理的研究。认知状态进行前瞻性的评估使用细微精神状态检查(MMSE);stereologic非功能性测试的评估,影响神经元和淀粉样蛋白总量在海马的CA1领域,内嗅皮层,和地区9所示。统计分析了使用单变量和多变量线性回归模型。
结果:高非功能性测试计数但不是淀粉样蛋白总量密切相关的数量较低影响神经元在各领域的研究。在MMSE分数很高比例的变化解释为非功能性测试和神经元数量在CA1领域(83%和85.4%),内嗅皮层(87.8%和83.7%),和地区9(87%和79%);淀粉样蛋白的体积内嗅皮层,但不是在CA1领域和区域9日占患者的58.5%的变化。多变量分析表明,非功能性测试计数内嗅皮层和总面积9以及神经元数量在CA1 MMSE得分的最佳预测指标。
结论:这些新的stereologic数据表明在额叶皮层和海马结构神经元病理密切反映了大脑衰老的认知缺陷的发展和广告。他们还表明,淀粉样卷没有额外的预测价值,临床病理的相关性,与非功能性测试超出其交互。
神经原纤维缠结(非功能性测试)、淀粉样蛋白沉积和神经元和突触丢失传统被认为是主要的neuropathologic广告的标志。非功能性测试和淀粉样蛋白沉积是岁一直在认知正常个体,但在广告情况下,它们的分布和密度,这样他们不仅反映严重破坏的海马通路(如穿甲弹路径),但皮层电路。1 - 3⇓⇓这两种病变出现贡献不同临床病理的相关性。4、5⇓特别是高非功能性测试的存在嗅皮质和海马神经元的密度是一个强大的关联记忆障碍的老化而大规模非功能性测试相邻组件内形成内侧颞叶皮层的伪劣方面与临床明显的广告。6 - 15⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓早期基于老年斑neuropathologic研究评估显示弱相关性淀粉样蛋白沉积和认知状态,16、17⇓但是最近的形态学和生化报告质疑这种观点。18 - 20⇓⇓
关于神经损失,举行的传统观念,普遍在大脑皮层和海马神经元死亡是不可避免的伴随正常的大脑衰老最近接受stereologic研究表明,事实上,在正常衰老神经元死亡是限制从地形上,可能占与年龄有关的皮层和海马功能的障碍。在21⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓而广告显然包括皮质神经元的死亡和电路退化,退化性变化既无处不在也都是在给定的皮质神经元类型地区同样受到影响。甚至早期或可能的广告定义的临床痴呆评定(CDR)得分0.5涉及广泛的(50%)层二世内嗅皮层神经元损失。21然而,一些轻微的广告情况下没有检测到颞皮层神经元的损失,这符合几项研究证明正常或轻度受损个体年龄没有显著的非功能性测试形成皮层区域。6 - 15⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓
两个主要的方法学问题也许可以解释一些差异在大脑衰老有关临床病理的相关性。估计AD-related病理学在大多数以前的研究与nonstereologic方法进行抽样偏差。最重要的是,即使严格stereologic方法已经被应用,20、30、31日⇓⇓AD病理特征通常是单独研究没有考虑到完善的交互中淀粉样蛋白沉积,非功能性测试的形成,神经元的损失。4、5⇓
我们之前报道的第一stereologic分析淀粉样蛋白总量在一系列前瞻性评估老年患者的大脑。20.我们已经完成了本研究通过评估非功能性测试和神经元总数在海马的CA1领域,内嗅皮层,和面积9在同一系列中,这里和现在的全球分析使用多变量模型,控制三方互动广告标志。
方法。
病人。
22个老年病人的大脑,呈现与正常老化程度的认知障碍或变量,得到尸检在12小时内死亡。临床数据得到病人的医疗记录和neuropathologic评估部门的神经病理学,西奈山医学院,纽约,或者老年病学和精神病学的部门,日内瓦大学医学院的瑞士日内瓦(表1)。所有情况下经历了神经心理学评估在6个月前细微精神状态检查他们的死亡和分数(MMSE)32可供所有人(见表1)。在所有的认知能力受损的情况下,广告严重程度进一步证实神经病理学的存在大量的非功能性测试和神经炎的改变在大脑皮层和海马结构使用Braak Braak登台,11和老年斑的出现和淀粉样蛋白沉积。20.所有程序的使用后期人类大脑进行书面同意后的病人和他们的家属,并被批准的相关伦理委员会在日内瓦大学医学院和西奈山医学院。
组织处理。
大脑都把尸检(后期延迟2到12个小时)和左半球在4%多聚甲醛固定。1 - 2周后,整个额上回海马结构包括、内嗅皮层被解剖,并放置在磷酸缓冲溶液含20%蔗糖。这两个样品被封锁定期使用专门设计的multiblade刀导致8到16块的组织(取决于该地区)所含的全部感兴趣的区域。这些板编号,注意每个块的吻侧表面。备用块加工对石蜡包埋或放置在分级vibratome蔗糖和削减。一个随机数决定奇数或偶数块是否会受到vibratome切片或用于石蜡包埋。石蜡包埋块是留给neuropathologic评价而备用块用于stereologic分析。本系列的每隔一块然后削减在50μm vibratome和免疫染色和组织化学处理。部分被保存在严格的解剖顺序缓冲区,和任何系列的差距。特别注意了失去少量的组织块之间的接口。 One section every 50 was then processed for immunohistochemistry, and depending on the case, five to eight sections were analyzed to sample exhaustively the region considered using a systematic random sampling scheme.33
免疫细胞化学。
所有材料都是使用单克隆抗体染色AD2,单克隆抗体识别过度磷酸化τ蛋白磷酸化网站Ser396-Ser404和可视化非功能性测试,神经纤维网线程和神经炎的斑块。34预处理后的95% / 5%甲醇/ H的混合物2O2防止内源性过氧化物酶反应,抗体AD2在工作使用稀释在4°C下过夜。特定的标签显示了生物素化的山羊antimouse抗体(1:50 0;向量实验室,伯林盖姆,CA), 3、3′-diaminobenzidine作为发色体。部分被复染色对甲苯基紫stereologic测定甲苯基violet-only染色神经元细胞内和细胞外的非功能性测试。淀粉样蛋白执行负载评估使用单克隆抗体4八国集团(ascite流体)针对淀粉样蛋白肽的序列17-24。抗体4八国集团是用来检测由Aβ1-40或Aβ1-42存款,因为它的抗原决定基不包括羧基末端,是共同的所有种类的淀粉样蛋白肽。35Fifty-micrometer-thick自由浮动部分处理甲醇/ H2O2解决方案(3/1 v / v)为30分钟,洗的磷酸盐(PBS)盐水缓冲30分钟。随后,部分提交88%甲酸预处理5分钟提高淀粉样蛋白检测。孵化与主抗体进行一夜之间在4°C,使用单克隆抗体4 PBS-saline八国集团(下)稀释,5%正常血清,0.5% Triton x - 100。部分被冲洗和孵化生物素化的antirabbit或antimouse免疫球蛋白G抗体(免疫球蛋白)(重+光)辅助解决方案(向量实验室,施用)1小时。标记的淀粉样蛋白沉积了avidin-biotin方法使用Vectastain ABC工具包(向量实验室)和3,3′-diamino-benzidine (DAB)作为发色体。部分为尼氏小染色加工,和盖玻片DPex(丙烯酰胺,密尔沃基,WI)。
确定感兴趣的解剖区域的边界。
我们遵循标准Amaral和Insausti解剖海马的边界条件和内嗅皮层。36为了执行stereologic分析区域9首先是必要建立考虑地区的解剖边界尽可能多的精度,以确保准确性和stereologic抽样的可靠性和有效性的估计。而这通常不是一个问题的初级视觉皮层,37或内嗅皮层和海马结构,38岁的21⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓这个以前没有解决区域9日的边界更复杂的区分和高度的案例可变性。为了解决这个方法学问题,我们依靠chemoarchitectonic模式识别的位置Brodmann区域9使用单克隆抗体SMI-32提出反对nonphosphorylated神经丝蛋白(单克隆抗体sternberg Lutherville, MD),标签分组人口的人类大脑皮层锥体神经元。39这种抗体提供非凡的chemoarchitectural锥体神经元的层流和区域分布的详细信息,允许可靠的解剖边界建立皮层领域之一。40抗体SMI-32使用在一系列工作稀释1:1,000部分毗邻那些沾抗体AD2,和处理如上所述。在免疫反应之前,SMI-32标签的所有部分进行预处理在10毫米水浴柠檬酸钠缓冲(pH值6.5)10分钟为最佳抗原性检索95°C。使用0.005% OsO SMI-32免疫反应性进一步增强4。这些并行的部分被用作区分从相邻的边界地区9指南(即皮层区域。,Brodmann areas 8, 46, 10, 32), and permitted an assessment of the variability of the extent of this region and its divergence from classic descriptions.
定量分析。
定量分析在计算机辅助图像分析系统组成的蔡司光学Axiophot显微镜配备了蔡司MSP65计算机控制机动阶段,蔡司ZVS-47E摄像机(蔡司、从、德国),Macintosh G3微机,和NeuroZoom(拉霍亚,CA),一个专门设计的形态和体视学的软件程序。37stereologic分析,光学分馏器方法被用来估计总数的神经元和非功能性测试(细胞内和细胞外)。每个Nissl-counterstained AD2-immunolabeled节第一次浏览低倍镜下(10×)概述了层内嗅皮层II或锥体层CA1场到计算机图像。第三层的面积9,同一个应用程序一旦边界或使用SMI-32-stained材料建立了该地区。这些层可以被明确Nissl-counterstained部分。由此产生的轮廓。NeuroZoom软件放置disector帧使用systematic-random设计在每个轮廓勾勒皮层层,考虑到预定的部分概述了区域。这个分数成立于试点研究的病例与变量严重程度和设置为容纳足够的锥体神经元的抽样和非功能性测试(注意,只有锥体神经元数)。一般都保持在2%,但在非常低的情况下明显的非功能性测试数字分数必须增加为细胞内非功能性测试高达20%。稀缺时,非功能性测试的总数估计所有可见的细胞外非功能性测试验证通过计算中使用的部分抽样方案(导致一个地区抽样比例为100%)。神经元尼氏小only-stained和非功能性测试,然后在这些disector帧数高倍镜下使用100×1.4数值孔径蔡司Plan-Apochromat目标,然后他们的总数估计如前所述。23日,25⇓disector高度保持在2μm和震源深度10μm一直探索在每个位置。的面积保持在900μm disector帧2在整个研究。平均而言,150年至600年资料统计在每种情况下。
淀粉样蛋白总量评估,每个区域的体积估计使用一个点计算网格和Cavalieri原则如前所述。20.每个地区的淀粉样蛋白总量的利息计算T= (Val/ Vl)* V裁判在弗吉尼亚州l被当地的淀粉样蛋白体积确定每个部分,Vl当地的地区确定为每个部分,和V裁判为整个区域的体积参考。所有测量值都是由两个独立的调查(结核病和P.R.H.),对受试者的临床状况视而不见。这些估计的有效性评估,调查人员计算同一地区在一些情况下具有高两分的可靠性(k = 0.90)。
统计分析。
neuropathologic变量正常化后,尼氏小only-stained神经元数目之间的关系(因变量)和年龄,非功能性测试总数,淀粉样卷(独立变量)在每个区域中使用线性回归研究了单变量和多变量模型。与临床病理特征的相关性,MMSE评分之间的关系(因变量)和neuropathologic参数(自变量)使用相同的统计方法进行了研究。考虑到有限的情况下,只有两个neuropathologic变量在每个多变量输入模型。使用占据软件包进行统计分析,发布7 (TX College Station)。
结果。
有一个强烈的负面关联总非功能性测试和神经元尼氏小only-stained号码在所有的研究领域(参见图e1补充,通过c,在www.neurology.org上;首页p< 0.0001)。淀粉样蛋白总量,减少神经元尼氏小only-stained数字只内嗅皮层(参见图e1补充,通过f d, www.neurology.org;首页p< 0.01)。在单变量模型中,非功能性测试数量占总变异的84.8%尼氏小only-stained神经元数量在CA1领域,内嗅皮层的86.7%,87.5%面积9。淀粉样蛋白负荷内嗅皮层解释50.7%的变异。年龄没有显著预测本系列中的神经元数目。
在多变量模型中包括非功能性测试计数和淀粉样体积,非功能性测试总数仍密切相关,减少神经元尼氏小only-stained数字(在各领域的研究p< 0.001),84.2%,86.7%,和87.2%的变异性在CA1领域,内嗅皮层,和面积9。淀粉样蛋白量没有明显与总相关神经元计数的研究领域。
MMSE评分和neuropathologic参数之间的关系是非常重要的非功能性测试和神经元数量在所有的研究领域(参见图e2补充,通过f, www.neurology.org)。首页在单变量模型中,一个非常高的比例的变化在MMSE得分是解释为非功能性测试和神经元数量在CA1字段(83.0%和85.4%),内嗅皮层(87.8%和83.7%),和面积9(87.0%和79.0%)。只有淀粉样蛋白的体积内嗅皮层明显相关的临床结果和占58.5%的MMSE可变性(通过我看到补充图e2, g, www.neurology.org)。首页年龄没有显著预测MMSE评分在本系列。
在多变量模型中,包括非功能性测试计数和淀粉样体积,非功能性测试的总数在CA1领域高度预测MMSE评分(R2内嗅皮层(R = 0.82)29 (R = 0.87),区域2= 0.84)。在多变量模型中,包括神经元计数和淀粉样蛋白负荷,神经元尼氏小only-stained数字高度预测MMSE评分(R20.85在CA1领域,在区域内嗅皮层的0.87和0.77 9)。在所有的淀粉样蛋白总量相关领域研究没有明显MMSE评分在任何上述多元模型(表2)。当非功能性测试和神经元数量,同时考虑了非功能性测试的数字内嗅皮层(R29 (R = 0.89)和区域2= 0.87)以及神经元数量在CA1领域(R2= 0.88)预测MMSE得分(见表2和图)。
讨论。
本研究的优势包括定量分析AD-related损伤和神经元数量使用无偏严格stereologic方法以及使用多元统计分析模型,可以估计每个neuropathologic测量的预测价值考虑相互作用的强度。我们的研究结果支持非功能性测试——但不是淀粉样deposit-related神经元损失广告。非功能性测试的总数可以解释84%以上的可变性神经元数量在海马的CA1领域,内嗅皮层,表明非功能性测试形成和面积9日是最重要的事件在这些领域与神经元有关损失。几个以前stereologic nonstereologic定量研究也报道强烈的非功能性测试计数之间的关系和神经元损失在同一地区和表明NFT-dependent神经元损失可能是大脑皮层的规则。22日,41 - 45 30日⇓⇓⇓⇓⇓⇓然而,几乎15%的神经元在各领域的损失不能被解释为非功能性测试。这相似之处的发现Gomez-Isla et al .,22神经退行性病变和暗示non-NFT-related机制也可能妥协脆弱的皮质神经元的子集。尽管这些机制在很大程度上仍投机,最近的贡献推测,细胞凋亡,氧化应激和excitotoxic机制发挥关键作用诱导神经元死亡,早非功能性测试在一些地区形成。30.重要的是,大量的淀粉样蛋白总量之间的联系和内嗅皮层观察到神经元损失在单变量分析对非功能性测试数据调整后消失在多变量分析。观测表明,它不太可能,淀粉样沉积过程中起着重要作用触发神经元损失。20.
神经元和非功能性测试数字领域相关研究与MMSE分数。此外,淀粉体的体积内嗅皮层也与认知状态在单变量模型,但这种关系是大大弱于观察到的其他两个neuropathologic参数。这个同意一些更早的研究指向弱老年斑密度和痴呆严重程度之间的联系。6、8 - 10,12 - 15⇓⇓⇓⇓⇓⇓⇓多元分析显示,只有总非功能性测试计数和神经元的数量在任何领域研究是认知状态的预测。这些观测结果表明,认知的相关报道的淀粉样蛋白在以前的单变量分析是反映了其与非功能性测试的相关性。有趣的是,我们最近也报道了类似的现象提出的关于非功能性测试和Aβ-protein沉积分段模型Braak和合作者。46在这项研究中,非功能性测试Braak分期和年龄解释27%的临床变异性CDR分数和添加Aβ-protein分期只能解释一个额外的2.9%。这些结果也平行观测grob et al .,显示在未来的系列调整非功能性测试消除认知措施和淀粉样蛋白之间的关系的负担。47然而,应该牢记的是,当前的研究并没有解决可能的有害影响认知的可溶性prefibrillar Aβ-protein总成,这可能更重要的神经毒性效果比淀粉样斑块的负担。48
与之前的研究结果相一致,强调海马结构,21日,22日,24日,25日,27日,38⇓⇓⇓⇓⇓数据在CA1领域加强认为神经元损失可能导致认知能力衰退形成独立与非功能性测试的相关性。在海马细分,神经元损失在这个领域不是年龄而是代表一个neuropathologic早期广告的标志。25日,26日⇓虽然NFT-independent神经元损失的百分比在这个领域相对较低,这似乎扮演着一个关键角色,认知能力下降,可能是因为储备有限的可行的神经元。
NFT-Braak登台的适度的表现相比,46我们的多变量分析表明,stereologic评估的非功能性测试计数内嗅皮层和面积9或神经元总数在CA1领域可以预测在MMSE分数超过87%的变异性。其余的细微变化可以归因于突触损失比例,一个neuropathologic标志强烈与认知相关的广告。49解释这些数据时,应考虑当前系列仅包括数量有限的情况下与MMSE得分15至26。它已被证明,这些病例显示非功能性测试和Aβ数量大幅变化,影响的有效性与临床病理特征的相关性。46进一步stereologic研究包括在这个中间组突触损失的评估需要精确定义广告神经病理学老年人群的预测价值。
确认
由国家卫生研究院的基金支持AG02219 AG05138。
承认
作者感谢Drs。诉Haroutunian和D.P. Purohit帮助采购后期的大脑材料和neuropathologic评估、Drs。电子艺界Nimchinsky施密茨和c为有益的讨论,对于软件开发来说过w•b西博尔德作品博士年轻,c . Mourton-Gilles博士提供的抗体AD2,许和a, b . Wicinski G.I.林、诉Oruganti, c . Buitron专家技术援助。
脚注
附加材料与本文可以发现首页网站。去www.neuro首页logy.org和向下滚动5月13日发行的目录找到本文的标题链接。
- 收到了2002年9月6日。
- 接受2003年1月30日。
