文摘
摘要目的:我们形成一个多合作为了比较抗肌萎缩蛋白量化方法,最可靠的方法达成共识,并报告其生物学意义的临床试验。
方法:5与专业实验室抗肌萎缩蛋白量化执行一组数据驱动的一个引用的比较分析正常和dystrophinopathy肌肉活检使用定量免疫组织化学和免疫印迹。我们开发了标准化的协议和评估国际米兰,intralaboratory可变性在范围广泛的抗肌萎缩蛋白表达水平。
结果:从不同的实验室结果高度整合以最小的国米intralaboratory可变性,特别是定量免疫组织化学。生成的数据之间有一个良好的水平的协议通过免疫组织化学和免疫印迹,虽然免疫组织化学更敏感。此外,意味着抗肌萎缩蛋白水平取决于替代定量免疫组织化学方法高度可比性。
结论:考虑肌纤维膜肌营养不良蛋白的生物学功能,我们的数据表明,定量免疫组织化学和免疫印迹的结合使用是可靠的生化结果措施杜氏肌萎缩症的临床试验,并且标准化的协议可以胜任实验室之间的可比性。验证的方法在我们的研究将促进实验性疗法的发展集中在肌营养不良蛋白生产和监管部门的批准。
术语表
- 弹道导弹防御=
- 贝克尔肌肉萎缩症;
- BOM-SG=
- 生化结果措施研究小组;
- 简历=
- 变异系数;
- DMD=
- 杜氏肌萎缩症;
- 免疫球蛋白=
- 免疫球蛋白G;
- 美国公共电视台=
- 磷酸盐
杜氏肌营养不良症(DMD)的x染色体神经肌肉障碍由突变引起的DMD防止其产品的表达的基因,抗肌萎缩蛋白。1,2温和的贝克尔肌肉萎缩症(BMD)也是造成的DMD由于基因突变而导致的变量更短的肌营养不良蛋白的表达。1,- - - - - -,5治疗性干预旨在恢复肌营养不良蛋白表达在临床试验。6,- - - - - -,14肌营养不良蛋白量化为这些试验是一个重要的生化结果测量。然而,没有参考标准的情况下,大尺寸、低蛋白的表达,结合现有dystrophin-positive回复突变体纤维和残余微量抗肌萎缩蛋白,15作出准确的量化具有挑战性的,尤其是当恢复肌营养不良蛋白的量很小。15,16因为监管机构此前表示,缺乏共识标准化方法的进步的障碍,17一群来自学术界和工业界的实验室成立了一个生化结果测量研究小组(BOM-SG)提供一个数据驱动的可再生的肌营养不良蛋白量化方法。在试点研究比较喜欢个人的敏感性和可靠性实验室的方法,我们发现显著水平的国际米兰——intralaboratory可变性(数据未显示)。本文报导的控制分析,提出了定量免疫组织化学和免疫印迹标准操作程序进行评估的抗肌萎缩蛋白表达。我们讨论我们的数据的生物学意义的背景下,营养不良的肌肉病理。我们证明可以比较来自不同实验室的数据,从而验证免疫组织化学和免疫印迹作为DMD的生化标志物的临床试验。
方法
五个实验室BOM-SG (Dubowitz神经肌肉中心,伦敦大学学院儿童健康研究所的,伦敦,英国;Flanigan实验室基因治疗中心,全国儿童医院,哥伦布市哦;英国纽卡斯尔大学遗传医学研究所;研究所de Myologie UPMC UM76 INSERM U 794年CNRS UMR 7215年,巴黎,法国;和Prosensa疗法,荷兰莱顿)进行盲法分析相同的一组肌肉活检(控制[n = 2], DMD (n = 3),和弹道导弹防御(n = 3)) (表1使用标准化的免疫组织化学和免疫印迹协议)。
标准协议的审批、登记和病人同意。
我们获得书面知情同意使用存档肌肉组织从所有的病人或监护人(适当地)在协议批准的全国儿童医院的机构审查委员会。大奥蒙德街医院进行的研究在国家研究伦理委员会的批准(05 / MRE12/32)。
肌肉活检。
我们选择肌肉活检之前存档的曼联Flanigan Dystrophinopathy工程实验室。所有活检评估了肌营养不良蛋白含量在临床或研究的基础上,摒弃标记为失明的代码,维护Flanigan实验室。18每个实验室获得相同数量的不固定的冷冻系列10-μm横肌部分在显微镜载玻片和一个包含40 10-μm埃普多夫管部分冻结的肌肉组织。所有实验室被告知的身份控制活检。
免疫组织化学。
染色协议,基于泰勒et al .,18是如下:
横截面是风干在室温20到30分钟,与疏水环绕peroxidase-antiperoxidase钢笔。
主要的抗肌萎缩蛋白(兔子c端ab15277;Abcam, Cambridge, MA)和血影蛋白(单克隆NCL-SPEC1;徕卡微系统公司,布法罗格罗夫,IL)抗体稀释(分别1:400和1:10 0)磷酸盐(PBS)和孵化的部分1小时在室温下。
部分在PBS洗(3×)3分钟。
每个实验室使用二次抗体兼容他们的显微镜,例如,Alexa萤石488山羊anti-mouse免疫球蛋白G(免疫球蛋白)(A11017;分子探针,尤金或)和Alexa萤石568山羊anti-rabbit免疫球蛋白(A11036;分子探针)。这些在PBS稀释1:50 0和孵化30分钟在室温下在黑暗中。
部分被洗(3×)在PBS为3分钟。
幻灯片是安装使用anti-fade安装代理,例如,延长黄金anti-fade试剂(分子探针)。
所有实验室测量肌营养不良蛋白强度使用Arechavala-Gomeza方法,衡量的荧光强度40具体sarcolemmal感兴趣的区域19随机选择手动。每一个感兴趣的区域包括最大和最小强度数据分析中使用的数据点。并行3实验室(1、4和5)也使用泰勒方法量化肌营养不良蛋白。18这种方法利用双染色血影蛋白,另一个sarcolemmal蛋白质的水平是影响dystrophinopathy肌肉,创建一个面具,只定义了sarcolemmal区域在每个图像。这个面具允许sarcolemmal强度的测量区域的整体形象。18此外,实验室4血影蛋白面膜的使用现场方法还用于选择每个单独的肌纤维膜纤维的形象。20.用这个算法,平均350纤维的强度测量和平均肌营养不良蛋白纤维强度计算人口使用定义的软件。20.这些方法之间的关键区别与纤维的数量测量每捕获的图像。对于每个方法的详细协议,看到e-Methods首页®网站首页Neurology.org。
西方墨点法。
协议,基于泰勒et al .,18是如下:
样品中可溶性裂解缓冲(4.4毫米三,9%十二烷基硫酸钠、4%甘油、5%β-mercaptoethanol)。
装载25μg蛋白质,每个实验室使用他们喜欢的凝胶电泳(一般3% - -8% tris-acetate梯度凝胶)和免疫印迹设备。
膜与anti-dystrophin孵化主要抗体(ab15277) 1μg /毫升一夜之间在4°C 5%牛奶TBS-T(三羟甲基氨基甲烷缓冲盐液,0.1% Tween20)。
一个sarcomericα-actinin主要抗体(克隆EA-53;σ,圣路易斯,密苏里州)稀释在5%牛奶1:3,000 TBS-T添加和膜在室温下培养1小时。
膜清洗(3×)PBS-T各10分钟。
二次抗体兼容实验室的成像设备被使用,例如,辣根peroxidase-conjugated山羊anti-rabbit(1:15,000)和山羊anti-mouse免疫球蛋白(1:500,000)孵化与膜在室温下30分钟。
膜清洗(3×)TBS-T各10分钟。
每个实验室使用他们喜欢的图像采集设备(如图像J-based软件,奥德赛红外成像系统);数据规范化α-actinin并提出相对于平均2控制。
统计分析。
实验进行了一式三份和统计分析使用GraphPad Prism 5.03版本(GraphPad软件,拉霍亚,CA)。变异系数(CV)是使用公式计算简历= SD /×100。intralaboratory分析,每个实验室的简历为每个切片计算(表e 1 e-6)和6切片的CVs平均为每个实验室。
Bland-Altman情节被用来评估不同的方法之间的协议。21
结果
每个实验室样品根据排名相对的抗肌萎缩蛋白表达水平取决于每个技术(表1)。有一个高水平的协议在所有实验室免疫组织化学和免疫印迹。所有实验室确认3 BMD样品蛋白质含量最高的抗肌萎缩蛋白,虽然上面的顺序不同免疫组织化学和免疫印迹之间。通过免疫印迹分析,实验室只能检测样本中肌营养不良蛋白B和2实验室(3和4)可以检测微量的肌营养不良蛋白蛋白质样品E。
国际米兰,intralaboratory可变性的肌营养不良蛋白量化使用免疫组织化学。
从每个实验室的数据(Arechavala-Gomeza19方法),我们计算均值(±SD)肌营养不良蛋白水平的每个样本和简历(图1)。总的来说,观察在不同实验室的变异性水平最小平均SD 7.78(介于3.33示例11.93 E和样本)。我们计算每个样本的简历统计测量实验室之间的差异程度。CV值不到20%被认为是最佳的。22CV值平均为33%(样本介于23%和67%样品B);样品A、C、D和F CV值在20%和30%之间。
五个实验室每个量化的肌营养不良蛋白表达水平相同的6切片使用标准化的免疫组织化学的协议;数据分析使用Arechavala-Gomeza方法。19评估多个实验室的可变性,每个切片的平均数±标准差计算以及变异系数(CV)。注意这个变化是较高的样本含有更少的抗肌萎缩蛋白(E和B)。评估intraassay精度在每个实验室,每个实验室每个样本的平均数±标准差计算以及平均每个实验室的简历。实验室不明。
我们下一个分析intralaboratory变化以同样的方式(图1)。我们计算的平均CV值从每个实验室e 1 e-6个人数据(见表)。免疫组织化学的CV值低于30%的实验室,实验室4和5有CV值低14%和14%,分别。
在所有的实验室都能够使用Arechavala-Gomeza方法,19一些实验室访问软件,使他们能够直接比较该方法与额外的自动化方法。三个实验室(1、4和5)分析同一样品使用泰勒方法和一个实验室(4)3种不同方法相比(Arechavala-Gomeza,19泰勒,18和现场20.方法)。我们分析了相同的图像使用以上强度测量技术,我们评估了他们之间的协议通过绘制每个样本的平均(±SD)对所有技术(图2一个)。下一个,而不是计算相关系数,可以隐藏相当缺乏的协议,23我们绘制数据回归线,策划更自动化的泰勒18或现场20.方法对Arechavala-Gomeza19方法(图2 b)。然后我们选择2由多个实验室(Arechavala-Gomeza方法19和泰勒18方法),观察到的平均数据2技术本质上都是相同的(图2中,A和B),生成的Bland-Altman阴谋(图2 c)。23这一分析表明,这两种方法是等价的:偏差(之间的区别意味着)只有2.103和10.83之间的协议是95%限制和−6.63。
国际米兰,intralaboratory可变性的肌营养不良蛋白量化使用西方墨点法。
我们评估水平的国际米兰,intralaboratory变化观察和免疫印迹(图3)。我们观察到更多的变化与免疫印迹免疫组织化学意味着SD为15.95(介于0.89样本33.09 E和F)。西方墨点法的CV值平均为80%(样品F介于23%和223%的样本E)确认与该技术更高程度的变化;只有样品D和F CV值接近20% (图3)。CV值特别受2的样品(B和E)在/低于灵敏度的限制;因此我们的研究结果表明,多个实验室的变化改善肌营养不良蛋白水平的增加。
五个实验室每个量化的肌营养不良蛋白表达水平相同的6活检使用标准化的免疫印迹的协议。评估多个实验室的可变性,均值±SD为每个实验室和活检是绘制条形图和平均变异系数(CV)实验室计算。评估intralaboratory变异,每个实验室每个样本的平均数±标准差计算以及平均每个实验室的简历。实验室不明。
Intralaboratory比免疫组织化学变化也更加明显。只有实验室1有一个最佳的CV值的0.3%;实验室3最高为119% (图3)。
免疫组织化学和免疫印迹数据比较。
评估水平的免疫组织化学和免疫印迹数据之间的协议,我们绘制每个样本的平均(±SD)这两种技术(图4一),绘制数据回归线(图4 b),生成Bland-Altman阴谋反对他们之间的区别方法的意思是(图4 c)。23偏见−14.18和64.96协议的上限和下限,−93.32,分别。虽然我们的样本量小,分散的数据点图4 c表明,随着平均增加2的区别方法也会增加。因此,免疫组织化学和免疫印迹数据有些类似,数据并不完美的协议;这是不太可能由于技术问题,而是不同的肌营养不良蛋白基因突变的性质。例如,存在着巨大的差异样品F (BMD患者外显子的缺失10-44)的抗肌萎缩蛋白水平量化由西方墨点法大大高于由免疫组织化学(见讨论)。
讨论
肌营养不良蛋白表达被用作二次测量结果在几个临床试验,但缺乏标准化的程序限制比较这些不同的研究的能力。
我们建立一个研究中,我们第一次标准化的方法检测抗肌萎缩蛋白表达,然后应用评估DMD患者BMD。我们的数据表明,优化免疫组织化学和免疫印迹出人意料地整合得到的变量性质dystrophinopathy活检(例如,变量fibro-fatty替代活检和变量之间的肌营养不良蛋白含量在相同的串行部分活组织检查)。我们表明,妥善处理组织可以分布到多个中心国际达到类似的结果。因为最近的研究表明,肌营养不良蛋白的表达不同控件,每个实验室我们分布式控制活检。19在临床试验中,这是需要考虑的一个变量,通过使用一组控制样本,可能是不现实的,或者使用人源化小鼠肌肉。24,25在任何情况下在临床试验中,使用每个病人的预处理或参与肌肉活检是至关重要的,因为变量水平的回复突变体纤维和跟踪每个病人的肌营养不良蛋白的表达。15,16
我们的研究表明,意味着抗肌萎缩蛋白水平获得使用3替代免疫组织化学方法比较,表明每活检报告当平均肌营养不良蛋白水平,选择哪一种发布脚本使用不是至关重要的,18,- - - - - -,20.虽然可以获得额外的信息和其他一些方法。26我们已经验证了鲁棒性,在一个多中心设置,Arechavala-Gomeza19(5)实验室和泰勒18(3)实验室方法评价结果的精度由不同的设备和运营商。现场20.方法只是测试一个参与的实验室。本研究的一个限制是,控制和测试标本的数量相对较小,因为它是极大的挑战获得人类肌肉活检所需大小的比较研究。
免疫组织化学和免疫印迹(分别测量sarcolemmal和总抗肌萎缩蛋白)提供的信息不一定相同,而是互补,特别是在肌肉病变。例如,在一些样品(例如,BMD样本,c.40_41delGA),肌营养不良蛋白的水平取决于这两种技术是高度类似,而与他人(例如,BMD样品F,德尔10-44交货),肌营养不良蛋白水平的量化通过免疫印迹明显高于由免疫组织化学。考虑到这个病人携带大量删除删除actin-binding域的很大一部分,27,28和能力的抗肌萎缩蛋白基因突变与肌纤维膜,在这种情况下我们建议西方墨点法高估了功能的肌营养不良蛋白的量。类似的结果也出现在转基因mdx老鼠携带BMD-like分子,低水平的mini-dystrophin sarcolemmal中观察到免疫印迹分数与老鼠全身肌营养不良蛋白表达。29日考虑到许多BMD突变(相当于DMD基因突变后外显子跳过)影响肌营养不良蛋白的三维结构和actin-binding性质,30.,- - - - - -,32捕获的肌营养不良蛋白总量在肌纤维膜的匀浆及其定位显然是重要的。评估使用的抗肌萎缩蛋白免疫组织化学也很重要,因为不同的表达模式可能会导致不同的功能结果无论蛋白质的总量。例如,在转基因mdx老鼠,老鼠低,但统一的肌营养不良蛋白表达有温和的表型mdx与更高的老鼠,但变量模式。33
免疫组织化学和免疫印迹不一定是最新颖的抗肌萎缩蛋白量化方法但仍广泛使用和访问。选择,但不广泛使用的技术,如质谱分析34和ELISA检测的线性增量可能是有利的肌营养不良蛋白从非常少量的样本。然而,他们使用的隔离不可取,因为相关问题上面讨论的肌营养不良蛋白基因突变的功能和定位。基于我们的研究结果,我们建议抗肌萎缩蛋白修复在临床试验中应该使用并行技术,量化,在层次结构的重要性:(1)sarcolemmal肌营养不良蛋白定量免疫组织化学,和(2)定量免疫印迹或替代技术测量总肌营养不良蛋白水平肌匀浆质谱等。计数dystrophin-positive纤维也使用,但没有评估多个实验室的可靠性;目前依赖于定性而不是定量操作定义为“积极的纤维。“然而,在一个实验室,计数的再现性dystrophin-positive纤维已经表示,尽管使用预处理阈值是至关重要的。7,9
我们的研究表明,当活检准备和抗体协议标准化,多个实验室能够可靠地使用现有技术测量肌营养不良蛋白的表达。因此,我们建议使用标准化的免疫组织化学和免疫印迹方法并行的生化结果措施DMD的临床试验。
作者的贡献
凯伦安东尼:起草/修订手稿内容、研究或设计概念,分析或解释的数据,采集的数据,统计分析,研究协调。弗吉尼亚Arechavala-Gomeza:起草/修改的手稿内容、研究或设计概念,分析或解释的数据,采集的数据,研究协调。劳拉·e·泰勒:研究或设计概念,贡献的重要试剂/工具/专利,研究监督和协调。艾德琳Vulin:分析或解释数据和获取数据。较Kaminoh:分析或解释的数据,采集的数据,统计分析。西尔维亚Torelli:分析或解释的数据,采集的数据,起草/修订手稿的内容。露西冯:起草/修订手稿的内容,包括医学写作内容和贡献的重要试剂/工具/专利。Narinder Janghra:分析或解释的数据,采集的数据。吉赛尔女佣:分析或解释数据和研究的监督/协调。莫德Beuvin:分析或解释的数据。 Rita Barresi: revising the manuscript for content, acquisition of data. Matt Henderson: revising the manuscript for content, contribution of vital reagents/tools/patents and acquisition of data. Steven Laval: analysis or interpretation of data. Afrodite Lourbakos: drafting/revising the manuscript for content, including medical writing for content, study concept or design, and analysis or interpretation of data. Giles Campion: drafting/revising the manuscript for content, including medical writing for content, analysis or interpretation of data, and study supervision or coordination. Volker Straub: study concept or design, analysis or interpretation of data, acquisition of data, study supervision or coordination, and obtaining funding. Thomas Voit: study concept and design, interpretation of data, study supervision, and obtaining funding. Caroline Sewry: drafting/revising the manuscript for content. Jennifer Morgan: drafting/revising the manuscript for content, study concept or design, analysis or interpretation of data. Kevin M. Flanigan: drafting/revising the manuscript for content, including medical writing for content, study concept or design, analysis or interpretation of data, contribution of vital reagents/tools, acquisition of data, and study supervision/coordination. Francesco Muntoni: drafting/revising the manuscript for content, including medical writing for content, study concept or design, analysis or interpretation of data, study supervision or coordination, and obtaining funding.
研究资金
研究导致这些结果已经收到了以下资助慈善机构:欧盟第七框架计划(fp7/2007 - 2013)根据SKIP-NMD赠款协议号码305370;法语协会反对肌病(AFM)和威康信托基金会授予hicf - 1009 - 025 F.M.作者承认TREAT-NMD神经肌肉的支持网络。支持F.M.大奥尔蒙德街医院儿童慈善机构和国家卫生研究所生物医学研究中心大奥蒙德街儿童医院NHS信托基金会和伦敦大学学院。J.E.M.被威康信托基金会支持大学奖,目前支持的大奥蒙德街医院儿童慈善机构。K.M.F.支持国家神经疾病和中风研究所(R01 NS043264)和CureDuchenne。诊断设施在纽卡斯尔肌肉罕见疾病咨询小组服务支持中心的神经肌肉疾病(英国国民健康保险制度)。
信息披露
k·安东尼报告研究协会的支持法国肌肉疾病(AFM)期间进行的研究。诉Arechavala-Gomeza, l·泰勒,a . Vulin y Kaminoh, s . Torelli l, n . Janghra g .女仆m . Beuvin r . Barresi m·亨德森和美国拉瓦尔报告没有披露相关的手稿。a Lourbakos Prosensa的一名雇员,其中包括参与期权计划。g .剪秋罗属植物是一种Prosensa控股公司和员工持有公司股票。版诉Straub写收到担任科学顾问委员会的谢礼辉瑞和Genzyme /赛诺菲。他是一个编辑委员会的成员神经肌肉疾病,神经肌肉疾病杂志,Neuropadiatrie Klinik和实践。他收到研究学会下属的支持肌病,西尔维亚•艾特肯慈善信任,行动医学研究,欧盟委员会(European Commission),英国医学研究理事会,父项目肌肉萎缩症、肌肉萎缩症协会,LGMD2I研究基金。t我们报道的SAB成员PROSENSA飞镖,8项专利的发明人,副主编神经肌肉疾病π3正在进行的临床试验(PTC, PROSENSA)和接收学术研究支持欧盟FP 7 SKIP-NMD SCOPE-DMD, BIOIMAGE-NMD。c . Sewry版税报告从2 books-publishers爱思唯尔和Wiley-Backwell;她也是编辑部的一员神经肌肉疾病和肌肉和神经和执行主编神经病理学和应用神经生物学。j·摩根报告没有披露相关的手稿。k . Flanigan担任网站研究员研究由葛兰素史克,PTC疗法,光环疗法,和Prosensa疗法;在顾问团Sarepta疗法;和礼来公司顾问。他已经收到了来自美国国立卫生研究院研究经费,父项目肌肉萎缩症,CureDuchenne是编辑部的一员神经肌肉疾病。f . Muntoni曾在科学顾问委员会罗氏、PTC,峰会,Italfarmaco, Sarepta疗法;他是辉瑞公司的科学顾问委员会的编辑委员会神经肌肉疾病和Neuropediatrics;他的机构(UCL)接收研究支持欧盟、英国医学研究理事会,威康信托基金会,法语协会反对肌病(AFM),肌肉萎缩症的运动,大奥蒙德街医院生物医学研究中心(天哪),葛兰素史克,Genethon,国家卫生研究院。他的机构(伦敦大学学院和天哪)收到葛兰素史克公司资助的临床试验,Trophos, Prosensa,英国心脏基金会,峰会,已收到资金从AVI生物制药和PTC疗法试验。去首页Neurology.org为充分披露。
承认
作者欣然承认埃里克·霍夫曼博士(国际儿童医学中心,华盛顿特区的其他成员BOM-SG),克里斯蒂布朗博士(国际儿童医学中心,华盛顿特区的其他成员BOM-SG), Heather Gordish-Dressman博士(国际儿童医学中心,华盛顿特区的其他成员BOM-SG),亚历山德拉Ferlini,医学博士,博士(费拉拉大学、意大利、额外的成员BOM-SG),医学博士,史蒂文•摩尔博士(爱荷华大学,额外的成员BOM-SG),黛安•弗兰克博士(BOM-SG Sarepta疗法,额外的成员),艾伦·韦尔奇博士(PTC疗法,额外的成员BOM-SG),达伦·钱伯斯(伦敦大学学院,技术帮助),和黛博拉Ridout(伦敦大学学院统计帮助)。
脚注
↵*这些作者的贡献同样这项工作。
↵‡这些作者的贡献同样这项工作。
去首页Neurology.org为充分披露。资金信息和披露认为作者相关的,如果有的话,年底提供这篇文章。本文所支付的加工费是伦敦大学学院的开放获取资助计划。
补充数据首页Neurology.org
- 收到了2014年3月14日。
- 接受的最终形式2014年9月2日。
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