文摘
摘要目的:执行genotype-phenotype分析在一个婴儿先天性关节弯曲由于新创错义突变NALCN离子通道和探索致病性机制使用秀丽隐杆线虫模型。
方法:我们执行whole-exome测序早产新生儿先天性关节弯曲,严重危及生命的临床过程。我们检查了致病性相关的机制NALCN工程突变的同源基因突变线虫C线虫使用CRISPR-Cas9。
结果:我们发现了一个新创错义突变NALCNc。1768C>T, in an infant with a severe neonatal lethal form of the recently characterized CLIFAHDD syndrome (congenital contractures of the limbs and face with hypotonia and developmental delay). We report novel phenotypic features including prolonged episodes of stimulus-sensitive sustained muscular contraction associated with life-threatening episodes of desaturation and autonomic instability, extending the severity of previously described phenotypes associated with mutations inNALCN。当设计到C线虫直接同源,这功能突变导致严重的表型,hypercontraction和不协调的运动。我们工程6附加CLIFAHDD综合症突变C线虫和作用机理可分为2类:半功能拟表型的突变体半拟表型功能丧失的突变体。
结论:我们的病人的临床表型和电生理学的研究表明持续的肌肉收缩来响应瞬态感官刺激。在C线虫通过功能,这种突变导致神经元过度活跃NALCN离子通道。测试人类NALCN的变体C线虫表明CLIFAHDD可以主导功能损失(或突变所引起的离子通道功能。
术语表
- CLIFAHDD=
- 先天性肢体挛缩以及面对张力减退和发育迟缓;
- CRISPR=
- 集群定期中间短回文的重复序列;
- IHPRF=
- 幼稚的张力减退和精神运动发育迟滞特征相
NALCN是守恒的阳离子通道电压门控钠和钙通道有关。NALCN家族的渠道表达整个神经系统在所有多细胞动物的研究并进行持续钠泄漏电流,导致神经元兴奋性滋补。1,2
空直接同源的基因突变NALCN老鼠、苍蝇、蠕虫导致广义与破坏的周期性行为如呼吸麻痹,昼夜节律,或有节奏的电动机电路。1,- - - - - -,4损失引起的这些行为很可能在这些突变体的神经元膜电位超极化。1,5丧失突变在人类NALCN已经被描述,这导致常染色体隐性条件导致小儿张力减退和精神运动发育迟滞特性相(IHPRF [MIM # 615419])。6,- - - - - -,8然而,一个新类的常染色体显性遗传NALCN突变被发现在人类小说表型特点是先天性的远端关节弯曲和撅面部表情暗示hypercontracted phenotype-designated先天性肢体挛缩以及面对张力减退和发育迟缓(CLIFAHDD综合症(MIM # 616266))。9,10因为有相当程度的表型重叠IHPRF患者,这些突变并假设函数作为主导-蛋白质,导致功能丧失的表现型。然而,overexpressing突变NALCN直接同源的秀丽隐杆线虫领导一组得出的主导channelopathy是由功能引起的NALCN。11
确定CLIFAHDD综合症是由收益或损失NALCN功能,我们设计的同源错义突变患者和其他6个人到出版C线虫由CRISPR-Cas9基因组。我们发现我们的病人的基本病理机制的突变的功能变化NALCN。然而,额外的突变模型C线虫证明的情况可能是由于功能和功能丧失离子通道的变化。
方法
家庭。
包括描述的家庭渊源者,早产新生儿出生在31日,4/7周的妊娠,她的不受影响,nonconsanguineous欧洲遗产的父母。
标准协议的审批、登记和病人同意。
我们获得的书面知情同意收集血液样本的DNA提取。咨询之前执行临床whole-exome测序为所有参与者。犹他大学的机构审查委员会批准了这项研究(25651年IRB K.J.S.)。
外显子组测序和变异分析。
我们进行诊断whole-exome测序在三使用DNA从全血中提取。血液基因组DNA提取使用Gentra Puregene工具包(试剂盒,瓦伦西亚,CA)。外显子捕获与安捷伦SureSelect工具包(安捷伦科技公司,圣克拉拉,CA)和测序2×100碱基对配对的Illumina公司HiSeq 2500年结束(Illumina公司,Inc .,圣地亚哥,CA)。序列对齐Hg19使用burrows - wheeler对准器(0.5.11),和变异被称为基因组分析工具包(v.1.6)。超过92.7%的基地测序质量分数大于10,变异与质量分数< 10被移除,以避免假阳性。我们排除了变异的等位基因频率大于1% dbSNP数据库(单核苷酸多态性),1000人基因工程,6500外显。进一步过滤同义变体,深intronic变体,和5′和3′未翻译区。我们证实了家庭关系与短串联重复序列标记。的NALCN变体被Sanger测序证实。
C线虫菌株和遗传学。
使用标准菌株培养和维护方法。12在这项研究中使用的所有菌株和质粒(表列出e 1首页Neurology.org)。CRISPR-Cas9修复模板是由吉布森克隆13pBluescript包括:1 - 3 kb同源臂同源NALCN突变nca-1,loxP-flankedunc - 119 (+)积极的选择盒(内含10),和PAM沉默突变的识别网站。指导RNA结构是由金门益生元退火。质粒DNA注入的生殖系unc - 119 (ed3)动物包括Cas9-pDD162 (30 ng /μL),14修复模板(30 ng /μL),指导RNA (30 ng /μL)和coinjection负选择的标记染色体外的数组。CRISPR事件被检测到unc - 119救援,生存之后peel-1表达,没有红色荧光表达。野生型控制是由孤立CRISPR事件,包括unc - 119 (+)选择,但没有突变。的unc - 119 (+)选择标记被切除所有菌株的基因组CRE recombinase-pDD104的注入14与pBluescript (50 ng /μL)和coinjection标记。
C线虫分析。
序列比对和氨基酸的位置都是基于,拯救对碘氧基苯甲醚nca-1d(wormbase释放WS247)。照片被捕获的蔡司Axioskop复合显微镜20×空气目标(卡尔蔡司显微镜,LLC Thornwood,纽约)。歌曲是由动物爬行3分钟新鲜OP50盘子。我们拍摄轨道解剖范围和追踪他们在Adobe Photoshop (Adobe Systems Inc .)圣何塞,CA)。行为得分进行盲目在盘子里上演得分前10 L4-larva 24小时。所有的菌株包括在本研究中复制随机混合在一起。涕灭威盘子准备了2毫米在琼脂涕灭威。所有菌株都化验在一个盲法试验复制从每个应变包括6试验。试验,每板10动物被放置和瘫痪是评估每15分钟。瘫痪的得分是基于完全停止运动,缺乏应对的鼻子。
结果
临床评估表明持续的神经活动导致肌肉hypercontraction。
产前和新生儿。
渊源者是一个女婴儿出生在31日,4/7周的妊娠,剖腹生产后发现羊水过多和异常胎儿心脏轮廓。呼吸窘迫在场。插管尝试但失败因为小嘴巴,microretrognathia,下巴挛缩。她最终需要插管在手术室完全瘫痪。她从出生是高血压。
变形特性。
独特的颅面特征和远侧地的肢体挛缩明显出生时(图1)。
异常运动活动。
她展示了胳膊和腿的节奏hypercontraction描述为骑自行车,鬼脸,眼睑肌强直无法放松几分钟。这些事件每天发生80×,卡马西平和治疗试验,苯巴比妥,levetiracetam,或苯妥英无所作为;然而,氯硝西泮适度减少有节奏的肢体活动的频率和严重程度。严重发作,她全身僵硬,血氧饱和度下降尽管通风。
自主的不稳定。
在接下来的几周,她经历了周期性的生命自主危机与呼吸暂停,心动过缓,恶化高血压、高热和反复稀释事件响应程序处理包括吸入或重新定位。
电生理学的研究。
中枢神经系统。
脑电图进行4次,其次是几天的连续床边监测癫痫活动。脑电图背景活动异常透露表现为偶尔的节奏放缓。然而,我们观察到没有癫痫样的活动在有节奏的法术腿骑自行车,呼吸暂停,心动过缓,高血压,或增加肌肉紧张性。
外围神经系统。
肌电图和神经传导测试证明严重减弱尺骨,中位数,腓骨复合肌肉动作电位振幅(预期正常值< 10%)保存值感官反应。针插入在近端和远端肌肉肌电图异常引起持续的运动单位招聘5分钟与持续可见的肌肉收缩,尽管没有进一步的针运动。偶尔neuromyotonia观察和复杂的重复放电,但仅限于远侧地内在支配手的肌肉。没有观察到肢体肌肉肌强直,即使在远端冷却。我们指出适度减少招聘相对正常的运动单位远侧地的支配肌肉,但招聘更多的近端肌肉出现正常。总的来说,异常肌电图和神经传导研究的模式支持为主的过程最严重影响远侧地的支配肢体肌肉。然而,最引人注目的临床异常出现的明显推迟放松肌肉激活后导致无意识的肌肉持续收缩最主要影响咬肌、口周的,眼周的面部肌肉,喉,胸部及上肢近端肌肉。一集EMG测试期间导致无意识的下巴关闭和喉部肌肉过度活跃与稀释坚持整整5分钟。在这段时间里,在咬肌运动单位的外表和招聘出现完全正常,但不自觉地持续,说明可能的运动神经元轴突兴奋过度。
神经影像学研究。
大脑MRI显示点状的和线性nonhemorrhagic焦点在室周的白质T2 fluid-attenuated反转恢复和t1加权图像,符合prematurity-associated受伤。磁共振血管造影和磁共振光谱学是正常的。
外显子组测序确定了杂合的突变NALCN。
外显子组测序的渊源者和家长发现了一个新创的突变NALCN(c.1768C > T;p.Leu590Phe)(图e 1)。突变是小说,但相同的突变已经发表在一个无关的CLIFAHDD综合症患者。9突变在第二域映射到S6段地区形成通道门口相关电压门控钠通道(图2中,A和B)。17,18这种突变可以创建一个既定的明渠,结果在一个主导功能缺陷。此外,大约409 kb的重复4 q32.3被SNP芯片检测。这个地区的基因不是已知的与疾病有关,考虑到重复的体积小,不太可能有助于患者的表型。
(一)NALCN预测图拓扑。罗马数字标签域和S1-6表明跨膜段。错义突变与圆圈和标签显示人类氨基酸的变化(例如,C线虫ox352647 D→E Ce / Hs 600)。多次出现在括号(X #)表示。渊源者的变体(*)2附近地图功能C线虫突变(粉红色)域II S6。剩下的圆圈表示所有功能发表人类CLIFAHDD或蠕虫病毒的突变。8,- - - - - -,11填充颜色代表的功能研究结果(紫红色=功能;蓝色=功能丧失;灰色=没有测试)。人类和(B)C线虫域II S6跨膜段(灰色框)是一致的。相同的(*)和类似的(^)残留表示。氨基酸的变化人类和线虫序列表示如下。CLIFAHDD =先天性肢体挛缩以及面对张力减退和发育迟缓。
验证的致病性NACLN突变C线虫。
为了测试这个模型,我们转向C线虫功能,功能丧失和等位基因同源NCA渠道的特点。19有两个冗余NALCN家人表达C线虫,nca-1和nca-2。丧失突变在两个同源染色体造成隐性表型:动物正常的身体姿势但当刺激通过触摸,爬了然后突然停止刻板的方式称为“昏厥。”相比之下,功能变体nca-1是显性的,导致张力亢进,体型较小,花的姿态(图3 b)。19,20.
(一)CRISPR修改nca-1。V F错义突变是本地制造的nca-1基因与unc - 119救援的积极的选择。Cre重组酶注射去除loxP侧面unc - 119选择磁带。(B)的姿势nca-1变体。野生型控制移动在一个肤浅的正弦波。动物工程渊源者的变体(V637F,樱红色圆圈)展览特点盘绕的姿势相同的动物功能与之前确认的等位基因(D647E,深粉红色和A643V,亮粉红色)。所有3变种semidominant和更深层次的身体移动比野生型弯曲。的颜色和符号提示在随后的板是一致的。(C)累积的行为nca-1变体。十L4幼虫化验每板6复制板/压力。24小时后的盘子是盲目的。每个竖线代表一个板;单杠代表的意思。分数的0到3中所描述的面板。(D)的运动nca-1变体。动物被放在新的盘子食物3分钟。野生动物探索大面积快速,而V637F, D647E, A643V菌株覆盖很少的区域不协调运动。(E)涕灭威的敏感性nca-1变体。涕灭威块突触间隙中乙酰胆碱的降解。动物表达人类的变种(V637F)和功能特征的变异(D647E和A643V)在涕灭威瘫痪的更快。所有菌株在这项研究中被分在一起,失明,在6复制实验。意思是平均6复制。N(板块)= 6;n(动物)= 60。(F) Aldicarb-time一半动物瘫痪(t1/2)。功能的突变(D647E)和渊源者的突变(V637F),涕灭威敏感性的增加导致减少50% t1/2比野生型控制(野生型意味着t1/2 = 70.8±4.9分钟,n = 72;D647E意味着t1/2 = 33.5±0.6分钟,n = 72,p< 0.0001;V637F意味着t1/2 = 35.8±0.7分钟,n = 72,p< 0.0001;普通1路的方差分析与Dunnett多重比较校正)。(G) Aldicarb-slope。功能菌株的变异(A643V)和渊源者的突变(V637F)显示一个瘫痪的速度以增加直线的斜率与野生型相比控制(野生型斜率= 3.6±0.8,n = 72;A643V斜率= 7.4±1.2,n = 72,p= 0.0061;V637F斜率= 7.5±0.8,n = 72,p= 0.0055;普通1路的方差分析与Dunnett多重比较校正)。误差线扫描电镜;* *p< 0.01,* * * *p< 0.0001。方差分析=方差分析;Wt =野生型。
我们策划的病人的NALCN突变(L590F)同源的位置C线虫基因使用CRISPR-Cas9系统生成NCA-1 (V637F)本机轨迹(图3一)。动物这一个残留变化与功能特征的突变NCA-1 (A643V),结果在一个既定的开放通道。19此外,人类突变的菌株的功能非常严重的突变NCA-1 (D647E)。所有这3个错义突变导致小体型和卷曲的姿势比野生型控制(图3 b)。我们用相同的策略控制应变突变;但是,没有突变。野生型的突变体很容易区分控制盲目行为得分分析(图3 c)。给3分钟新鲜食物,野生动物将探索距离大于20毫米。相反,动物A643V, D647E或V637F突变显示大幅减少运动(图3 d)。所有3变种展览semidominant继承;杂合的动物展览一个中间表型(图3 B和D)。
不协调的运动和卷曲的姿势是一致的神经功能障碍,但这种表型可以归因于突触传递的增加或减少。的动物被化验检测神经递质释放乙酰胆碱酯酶抑制剂涕灭威的敏感性。这种药物阻断乙酰胆碱降解,导致hypercontraction和兴奋性瘫痪。21菌株传播过剩在神经过敏的涕灭威的麻痹效果。功能已知的突变(A643V和D647E)和病人的突变(V637F)涕灭威超敏反应引起的,表明神经递质释放的增加C线虫神经肌肉接头(图3 e)。值得注意的是,零的突变nca-1以来对涕灭威敏感或行为没有影响吗nca-1和nca-2基因在功能上是冗余的。D647E和V637E突变尤其严重,麻痹的50%所需的时间在涕灭威蠕虫(麻痹t1/2)明显比野生型控制(短图3 f)。A643V应变显示相对较弱的超敏反应;然而,麻痹(斜率)的速度明显大于野生型控制(图3 g)。这些发现支持L590F在人类的分类NALCN作为一个主要功能,致病突变。
不同CLIFAHDD突变引起损益的通道功能C线虫。
功能测试是否所有CLIFAHDD突变引起的通道,我们工程6前所述错义变化C线虫nca-1(图2一个)。9我们使用相同的CRISPR-Cas9诱变战略。包括我们的病人的突变,7的14前所述CLIFAHDD突变进行了测试。通过评分的累积行为的动物,我们观察到光谱从野生型表型严重卷(图4一)。当这些nca-1突变被进入nca-2 (−)零背景、3株出现野生型(V359G、E373K Y625S)被证明是农民(基因型nca-1 [* / *] nca-2 [/−−])。晕倒的行为也观察到当突变杂合的基因型(nca-1 [* / +] nca-2[/−−]),表明他们是antimorphs。因此,这些突变破坏NCA-1通道功能占主导地位的方式,应该归类为功能丧失。剩下的4个突变显示没有晕倒的行为nca-2 (−)空的背景;相反,卷取的行为变得主观更引人注目。姿势的光谱中观察到的菌株显示明显的表型(图4 b)。当化验涕灭威敏感,这个子集CLIFAHDD突变引起的过敏症。压力形成一个等位基因的一系列基于t1/2严重性和瘫痪的速率(坡),类似于由行为(WT < F559V < T580N < L556S < V637F) (图4中,汉英)。相比之下,涕灭威敏感突变确定为农民没有影响(图飞行)。总之,我们的研究结果表明,突变负责CLIFAHDD综合征可能会扰乱NALCN通道功能通过增加或减少离子通道功能。
(A)的累积行为CLIFAHDD变体。分数的0到3展示每一个突变的致病的严重性表示。当进入nca-2 (−)零背景,亮粉红色的突变突出显示典型的“晕倒”行为。(B)的姿势CLIFAHDD变体。NCA-1 (T560N)和(F559V)菌株有微妙的变化在身体姿势略比野生型的身体弯曲。NCA-1 (L556S)和(V637F)菌株是强烈的。(C)涕灭威的敏感性CLIFAHDD变体。不协调/盘绕的子集CLIFAHDD突变导致涕灭威过敏症频谱的严重性。功能丧失的突变确定晕倒行为不过敏的涕灭威(图飞行)。(D) Aldicarb-time一半动物瘫痪(t1/2)。涕灭威的光谱t1/2过敏症是显而易见的。F559V突变(t1/2 = 71.0±2.8分钟,n = 72)的野生型控制(t1/2 = 70.8±4.9分钟,n = 72)。 The T580N (t1/2 = 59.5 ± 2.0 minutes, n = 72,p= 0.0177),L556S (t1/2 = 58.6±1.8分钟,n = 72,p= 0.0095)和V637F (t1/2 = 35.7±0.7分钟,n = 72,p< 0.0001)突变显示增加灵敏度的措施。Aldicarb-slope (E)。麻痹的速度被斜率显示一个类似的趋势。然而,野生型控制和突变体之间的差异没有达到意义(普通1路的方差分析与Dunnett多重比较校正)。误差线扫描电镜;*p< 0.05,* *p< 0.01,* * * *p< 0.0001。CLIFAHDD =先天性肢体挛缩以及面对张力减退和发育迟缓。
讨论
一个问题从诊断下一代测序是基因变异的分类小说。这个困难加剧了表型变异是由于遗传背景。一个可能的解决办法是比较新颖的变异生物模型与一个固定的遗传背景。在这里,我们使用了线虫C线虫测试7新创突变在人类NALCN基因负责CLIFAHDD综合症。我们发现与居多的遗传表型7变种都是有害的。因此,虫子似乎是一个很好的模型CLIFAHDD-all突变导致可衡量的表现型相同的遗传模式中观察到人类。
致病突变NALCN可以通过不同的模式分类的继承。IHPRF综合症是隐性的,似乎是由零因为他们截断NALCN突变蛋白。6,- - - - - -,8CLIFAHDD综合症是主导性继承和致病性错义突变所引起的NALCN。9先前的报道不同意CLIFAHDD暗示它可能造成蛋白质的机制或功能丧失。9,- - - - - -,11我们的功能分析C线虫证明结果都是可能的。我们发现的一个子集CLIFAHDD与功能特征明显的表型变异。这些突变集群在离子通道的门,可能增加电流。相比之下,我们还观察到一个类的突变,充当dominant-negatives线虫(antimorphs)。这些突变的动物显示一个刻板的“晕倒”行为。Antimorphic渠道可能导致聚合和野生型NALCN退化,类似于突变中描述钠和钙通道有关。22,23因此,3机制产生NALCN channelopathies: (1) IHPRF-recessive功能丧失,(2)CLIFAHDD-dominant功能,和(3)CLIFAHDD-dominant antimorphic。
不幸的是,人类表型不同的遗传机制的结果NALCN病理并不那么容易放入这些类别。IHPRF和CLIFAHDD“综合症”的特点是变形特性和神经发育疾病与大量的共享特性。IHPRF和CLIFAHDD病人显示区域张力减退和智力障碍,和每组的成员体验发作。最一致的特性完全归因于CLIFAHDD综合症是远端关节弯曲(报道18 19病人描述的日期)(图1)。9,- - - - - -,11远端挛缩没有指出与IHPRF描述的11个病人。6,- - - - - -,8我们的结果进一步复杂化这张照片,因为它看来,获得或丧失的突变NALCN会导致CLIFAHDD诊断。这些结果符合CLIFAHDD之间的重叠和IHPRF但与关节弯曲等显著特征。鉴于NALCN兴奋和抑制性神经元中表达,两边平衡电路通道将受到功能变化的影响。因此,电动机的输出给定电路是很难预测的,可能反映了系统稳态极限。因此,这些症状表型之间的重叠程度可能并不令人惊讶。
表型观察CLIFAHDD和IHPRF的确表明了NALCN离子通道功能非常广泛的神经系统。持续的肌肉过度活跃和放松肌肉支配肢体和颅的失败,与观察到的节奏的骑自行车活动四肢,认为这在上下运动神经元离子通道功能和相关电路的周围神经系统和中枢神经系统。兴奋过度的运动单位和由此产生的过度活跃的肌肉支配四肢和颅结构,如果存在在胎儿发育,有助于解释dysmorphology特点和远侧地的先天性挛缩观察这些病人。
重新定义CLIFAHDD综合症的机制变化的方法治疗这些患者。功能变异可能与离子通道阻滞剂减少目标细胞的兴奋性。需要进一步功能研究来识别特定的NALCN阻滞剂。然而,目前的药物用于癫痫或其他迹象可能被证明是有价值的候选人。另外,NALCN变异与功能丧失的机制可能会受益于一个全球细胞兴奋性的增加。不幸的是,这两个途径需要广泛的调查和临床试验。关键是,保健提供者实践提供这些药物之前一定要小心,因为不同的患者CLIFAHDD可能显著不同的反应方式。特别是测试特定的变体C线虫可能导致更准确的诊断和药物治疗。
作者的贡献
埃里克·g·本德:设计和概念化的动物模型研究,采集的数据,分析或解释的数据,起草/修订手稿的内容。悦Si:采集的数据,分析或解释的数据,起草/修订手稿的内容。大卫·a·史蒂文森:采集的数据,分析或解释的数据,起草/修订手稿的内容。Pinar Bayrak-Toydemir:采集的数据,分析或解释的数据,起草/修订手稿的内容。塔拉·m·纽科姆:起草/修改的手稿内容,研究协调。Erik Jorgensen:设计和概念化的动物模型研究,分析或解释的数据,起草/修订手稿的内容。凯瑟琳·j·Swoboda:设计和概念化的临床调查、数据采集、起草/修订手稿内容,分析或解释的数据,获取资金。
研究资金
国家研究资源中心奖ULRR025764犹他大学的临床转化科学中心提供了核心资源来帮助支持这项工作,包括DNA提取和测序核心设施。
信息披露
大肠弯曲,y . Si, d·史蒂文森,p . Bayrak-Toydemir, t·纽科姆报告没有披露相关的手稿。e·约根森是霍华德·休斯医学研究所研究员。k . Swoboda通过研究经费来自美国国立卫生研究院资助(NICHD) (R01-HD69045 (NICHD))和CDC (U01-DD001108)。去首页Neurology.org为充分披露。
承认
作者感谢家人允许他们的故事和他们的女儿的照片共享。他们也感谢Rob霍布森得分晕倒表型和陈Pin-An NCA-1的礼物(D647E)。
脚注
去首页Neurology.org为充分披露。资金信息和披露认为作者相关的,如果有的话,年底提供这篇文章。本文由作者支付加工费。
补充数据首页Neurology.org
- 收到了2016年1月21日。
- 接受的最终形式5月4日,2016年。
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