文摘
客观的在急性脑缺血,循环嗜中性粒细胞计数和neutrophil-to-lymphocyte比率(NLR)与中风的严重程度呈正相关,更糟糕的结果。介质的影响是未知的。我们旨在调查(1)等离子体之间的关系矩阵metalloproteinase-9 (MMP-9)和髓过氧化物酶(MPO)浓度与中风的严重程度和结果,(2)MMP-9和MPO释放后体外刺激中性粒细胞通过重组组织纤溶酶原激活物(rtPA)。
方法分析收集的数据在255年幕上的脑梗塞患者招募症状发病48小时内无论rtPA治疗。端点是优秀的结果(改良Rankin量表得分0 - 1),症状性脑出血(欧洲合作急性中风研究二定义),并在3个月内死亡。rtPA治疗嗜中性粒细胞脱颗粒外围的作用研究在18例后4.5小时和72小时。
结果嗜中性粒细胞计数、NLR和MPO等离子体浓度,但不是MMP-9,与中风的严重程度呈正相关。更高的中性粒细胞计数和NLR独立与较差的预后相关,更高的死亡率在3月。血浆浓度MPO值较高,但不是MMP-9,与更糟的结果。Neutrophil-derived MMP-9,经过体外rtPA刺激,但不是MPO,高72小时后患者的静脉rtPA但不伴有出血性转换。
结论嗜中性粒细胞计数、NLR和MPO等离子体浓度与更糟糕的结果在急性脑缺血患者,相比之下MMP-9。还需要进一步的调查来加深知识MPO在中性粒细胞的有害效应的作用,因为它可以代表一个潜在的治疗目标。
术语表
- HT=
- 出血性转化;
- 是=
- 缺血性中风;
- MMP-9=
- 矩阵metalloproteinase-9;
- MPO=
- 髓过氧物酶;
- 夫人=
- 改良Rankin规模;
- 署=
- 国立卫生研究院的中风尺度;
- NLR=
- neutrophil-to-lymphocyte比率;
- RPMI=
- 罗斯威尔公园纪念研究所;
- rtPA=
- 重组组织纤溶酶原激活物;
- 西奇=
- 症状性脑出血
更高的循环嗜中性粒细胞计数在缺血性中风(是)与中风的严重程度更高,更大的梗塞大小,增加出血性转化的风险(HT)和更糟糕的结果,1,2不管四重组组织纤溶酶原激活物(rtPA)管理。3,4一些观测结果表明,等离子体矩阵metalloproteinase-9 (MMP-9)可以负责中性粒细胞在急性的有害影响是:(1)有一个增加白细胞MMP-9 mRNA在第一中风发作后3小时5;(2)MMP-9血浆浓度较高的患者相比,控制6;和(3)更高MMP-9等离子体浓度与梗死体积大,7更糟的是中风的严重程度,7,8更糟糕的是功能的结果,8,- - - - - -,10HT的风险增加,无论使用IV rtPA进行治疗。9,11,- - - - - -,15因为MMP-9从中性粒细胞释放,这被认为是主要的中介效应。16
髓过氧化酶(MPO)血浆浓度,酶分泌激活中性粒细胞炎症期间,17被发现在急性患者增加。18抑制MPO活性导致动物减少梗塞面积。19一些数据也表明有害MPO活性对缺血后神经发生的影响20.和神经保护。21此外,rtPA可以促进体外和体内16从中性粒细胞释放早期脱粒产品,包括MMP-9和MPO。22
本研究的目的是调查,患者的急性,MMP-9和MPO等离子体浓度之间的关系(1)基线中风严重性,(2)循环中性粒细胞和neutrophil-to-lymphocyte比(NLR),和(3)的结果在3月。我们也调查了MMP-9和MPO释放后体外rtPA刺激中性粒细胞。
方法
包容和noninclusion标准
我们分析了40岁以上的患者中收集的数据,与幕上的,前瞻性地招募了症状发病48小时内2005年6月至2009年5月在Biostroke研究(NCT00763217),生物标志物的研究在里尔大学医院的中风研究中心进行。一亚组病人招募在4.5小时内症状发作为了评估MMP-9和MPO释放后体外rtPA中性粒细胞。患者纳入TIA或脑出血的Biostroke队列被排除在分析。病人并不连续,因为需要为所有的病人获得书面知情同意和执行之间的体外分析只有8我和2点每周3天的子群。
临床评估
中风的严重程度是由美国国立卫生研究院卒中量表评估(署)23在学习或包含在IV rtPA丸的患者接受了溶栓治疗。定义用于变量包括病史、血管危险因素,评估基线临床特点是那些由我们组在先前研究中使用。24结果被评估在一个面对面的拜访或电话采访在3个月内使用改良Rankin规模(夫人)。25
静脉溶栓管理
第四rtPA (Actilyse;,勃林格殷格翰集团、德国)是根据建议欧洲卒中管理组织26(即。,0。9mg/kg body weight, maximum 90 mg, 10% of the dose as a bolus, followed by a 60-minute infusion).
成像
所有的病人在两个军团经历了41 CT扫描(Somatom感觉16探测器;西门子、德国埃朗根)或核磁共振扫描(飞利浦阿奇沃(飞利浦、最佳、荷兰),1.5 t,与fluid-attenuated反转恢复,梯度回波T2 *,扩散b1000与表观扩散系数映射,和飞行时间序列)录取。所有患者接受了第二个神经影像调查CT或MRI 6 - 10天后Biostroke研究也24 - 72小时后的子群,或在任何时间的临床恶化。在病人静脉rtPA,第二个成像调查22日之间进行,治疗后36个小时。
嗜中性粒细胞计数和评价总活跃MMP-9和MPO血浆浓度
中性粒细胞和淋巴细胞计数和总活跃MMP-9和MPO血浆浓度测定血样画在包容和72小时后的子群。病人的血液样本rtPA溶栓前收集。
等离子体MMP-9和MPO浓度测定如下:所有样本收集到真空采血管管(法国正欲;Le Pont de Claix、法国)。血浆样本来自管含有肝素和保持冷冻,直到分析。
总活跃MMP-9水平(自由proMMP-9和自由MMP-9激活后使用APMA)在等离子体测量MMP-9活动分析系统(Fluorokine E,人类活动MMP-9;研发系统,Inc .,明尼阿波利斯,MN)。等离子体MPO被磁测量人类高灵敏度Luminex试验(微孔;圣昆汀·雷诺,法国),根据制造商的指示。这些化验根据制造商的建议进行重复同一天在同一运行允许直接比较。
中性粒细胞分离和体外刺激
在包容和中性粒细胞脱颗粒外围调查rtPA治疗病人静脉rtPA和72小时后所有的病人。根据我们先前所描述的方法,28从患者的中性粒细胞分离肝素化静脉血在Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离。中性粒细胞resuspended培养基(罗斯威尔公园纪念研究所(RPMI) 1640中)> 98%纯净,由血液学分析仪(XS800i;Sysmex公司,神户,日本)。然后,纯化中性粒细胞(4×105细胞每)被播种到24-well盘子和rpmi - 1640年培养基培养l谷氨酰胺、丙酮酸钠(英国柴郡Gibco BRL) 37°C, 5%的公司2。中性粒细胞与0.1毫克/毫升孵化rtPA 30分钟。中性粒细胞上层清液收集,离心机在14000 rpm(12分钟),并存储在−80°C到分析。参与细胞被用作控制。总活跃MMP-9(自由proMMP-9和自由MMP-9)和MPO测量条件媒体如上所述。
统计数据
定量变量表示为代表(SD)的正态分布或中位数(四分位范围)。分类变量表示为百分数(计数)。我们组对于分类变量相比,χ2测试耶茨校正或Fisher精确检验在适当的时候,与Mann-Whitney和连续变量U测试。常态分布的评估使用直方图和Shapiro-Wilk测试。
我们执行一个向后的多元逻辑回归分析结果,西奇,或3个月内死亡作为因变量。独立变量选择优秀的双变量分析的结果,0.10水平作为选择候选人的筛选标准变量。变量年龄、署、中性粒细胞计数、MMP-9和MPO等离子体浓度(模式1),和溶栓被迫到模型中。MMP-9和MPO等离子体浓度输入模型中作为分类变量与3水平根据tertiles初始参考类别更好地解释数据。关于MPO等离子体浓度,短裤被设置为52.3×1000 ng / mL第二tertile和91.8×1000 ng / mL第三tertile,而对于MMP-9浓度,短裤是设定在85 ng / mL第二tertile和第三tertile 159 ng / mL。一个变量计算MMP-9之间的交互和MPO tertiles也进入(模型2)。同样的2分析重复使用NLR代替中性粒细胞计数(模型3和模型4,分别)。随后其他模型构建与单个生物标记,而不是所有的组合:中性粒细胞计数(5)模型或NLR(6)模型或MMP-9(7)模型或MPO(模型8)等离子体浓度,后者2除以tertiles。变量之间的相关性检查可能的同线性,这被定义为r值> 0.6。数据使用SPSS 22.0分析了Windows和GraphPad棱镜6包。
标准协议的审批、登记和病人同意
Biostroke研究当地伦理委员会批准。患者管理根据当地规则没有任何调查或治疗具体执行。这项研究是向病人解释完全。所有的病人或近亲属签署了知情同意MMP-9和MPO的剂量。中性粒细胞和淋巴细胞计数被认为是作为常规治疗的一部分。
数据可用性
所有的数据用于分析本文提出了表和图。共享数据的伦理批准后如果要求其他调查人员为目的的复制结果。
结果
322名患者入选标准会议,67人(20.8%)不可能因为缺失数据分析延迟样本集合的中性粒细胞(5例)或等离子MMP-9和MPO浓度(20例),中性粒细胞计数(19病人),夫人在3个月(32例),或任何组合在同一病人。最后,分析中的255名患者(平均年龄70(57 - 79)年;116名女性[45.1%])和不同于患者排除只对较低比例的女性(45.5 vs 59.7%,p= 0.038),较低的基线中风严重性(6 [13]vs 8(三分之一),p= 0.026),没有intrahospital死亡发生(0和23.9%,p< 0.001)。
入学人口中风严重性和基线特征
255例患者,137例(53.7%)有一个低中风严重性(入学署分数≤5表1)。在人口学特征、中风的特点,和基线临床措施,只有没有历史的充血性心力衰竭(9 vs 22±7.6±16.1,p= 0.04,患者承认署> 5和署≤5,分别),没有rtPA治疗(41.6 vs 11.9%,p< 0.001),降低入学血糖水平(94.5 [86.7—-109.7]vs 112 (95 - 131.5),p< 0.001)都降低中风严重性。
承认中风严重性和生物参数
除了MMP-9血浆浓度,所有生物参数显著不同患者之间也没有承认署≤5 (表1)。患者入院署≤5中性粒细胞计数较低,NLR, MPO患者血浆浓度比承认署> 5。署时分析作为定量尺度,署呈正相关,中性粒细胞(r= 0.49,p< 0.001),NLR (r= 0.48,p< 0.001)和MPO等离子体浓度(r= 0.21,p =0.001)但MMP-9等离子体浓度相关性无统计学意义(r= 0.06,p= 0.359)。
rtPA和生物参数
患者通过rtPA NLR更高的中性粒细胞计数和高于病人没有被第四rtPA (表2)。相反,MMP-9和MPO等离子体浓度没有显著不同病人之间为IV rtPA合格与否。
调整和未经调整的相关性中性粒细胞计数,NLR, MPO和MMP-9等离子体浓度
嗜中性粒细胞计数明显与MPO以及MMP-9血浆浓度在所有患者(表3)。此外,NLR在所有患者与MPO等离子体浓度有关。
二元关系中性粒细胞和嗜中性粒细胞淋巴细胞比率(NLR)和矩阵metalloproteinase-9 (MMP-9)或髓过氧化酶(MPO)血浆浓度在所有患者
调整后署和发病样本延迟,循环嗜中性粒细胞计数MMP-9血浆浓度在所有患者有显著相关性(ρ= 0.215,p= 0.001)。NLR与MMP-9等离子体浓度显著相关(ρ= 0.146,p= 0.021)。
未经调整的功能结果之间的相关性和生物措施
除了MMP-9血浆浓度,所有生物措施显著不同患者之间,没有优秀的结果(0 - 1)夫人(表4)。患者的中性粒细胞计数较低,结果NLR, MPO患者血浆浓度比贫穷的结果。当夫人分析定量尺度,夫人呈正相关,中性粒细胞(r= 0.41,p< 0.001),NLR (r= 0.46,p< 0.001)和MPO (r= 0.30,p <0.001)血浆浓度,但MMP-9等离子体浓度相关性无统计学意义(r=−0.04,p= 0.518)。
生物措施对结果的影响
更高的中性粒细胞数量独立相关的概率较低有一个很好的结果,和更高的死亡率在3月,但没有与西奇的风险有关。更高的tertiles MPO等离子体浓度有关概率较低有一个很好的结果,但没有与高死亡率和西奇的风险。MMP-9等离子体浓度与这些结果没有关联措施(表5)。事实上,MMP-9之间的相互作用和MPO等离子体浓度,同时除以tertiles,是与较低的概率有一个优秀的结果只有当MMP-9的交互是最高的tertile MPO等离子体浓度(表5)。我们没有观察到相同的行为tertiles MMP-9血浆浓度最高。只有MMP-9中级tertile之间的交互和MPO tertile最低概率较低的等离子体浓度有关优秀的结果,但这一发现是不稳定的,因为它不能与其他的组合低或中间tertiles (表5)。
这些结果仍类似于三个不同的模型,与MMP-9孤独,独自MPO,中性粒细胞。结果甚至修改中性粒细胞计数的替代NLR单独或结合MMP-9和MPO血浆浓度或与他们的互动(表6)。
中性粒细胞隔离和脱粒
为了更好地理解如果MMP-9和MPO可以视为中性粒细胞的介质的影响,255年我们招募了18例(8(44.4%)的女性,平均年龄80年[74 - 88],和12个病人(66.7%)接受IV rtPA)。生物学特征的子组在基线和后72小时了表7。病人静脉rtPA相似的年龄和中风发作前的功能状态以及中风的严重程度患者没有收到IV rtPA。HT明显在病人静脉rtPA更频繁。此外,MPO等离子体浓度明显高于在入学资格的病人静脉rtPA相比,患者不合格,而任何差异被发现在72小时的病人接受与否IV rtPA治疗。任何差异被发现中性粒细胞计数,NLR, MMP-9血浆浓度在基线和后72小时。
Neutrophil-derived MMP-9和MPO浓度
因此,我们分析了子群MMP-9和MPO释放后体外rtPA刺激本地中性粒细胞在入学后72小时。在入学之前,溶栓(H0),没有发现差异在neutrophil-derived MMP-9和MPO浓度之间的病人或不是由IV rtPA (图中,A和B)。后72小时(H72),循环从患者中性粒细胞IV rtPA释放更多MMP-9 rtPA刺激比不治疗后(568±119 vs 229.8±23.75,p= 0.03;图,一个)。没有发现差异在H0 neutrophil-derived MPO和患者之间H72与否由IV rtPA (图B)。由于没有西奇例在这个小组,我们认为这次发现的任何HT在控制神经成像研究。然而,没有发现显著差异之间neutrophil-derived MMP-9 (图中,C)或MPO (图D根据治疗)浓度和HT。
直方图显示MMP-9的差异和MPO从中性粒细胞释放后体外rtPA刺激患者之间rtPA vs不治疗(A, B)和HT组vs non-HT组(C, D)。
我们探讨了MMP-9和MPO等离子体浓度之间的相关性,循环嗜中性粒细胞计数,NLR, neutrophil-derived MMP-9和MPO浓度对应的时候全部人口(表8)。我们的研究结果表明,在承认,neutrophil-derived MPO含量负相关,neutrophil-derived MMP-9。在H72 NLR MPO等离子体浓度呈正相关。
讨论
我们的研究表明,在症状出现后48小时内幕上的脑梗塞患者,(1)循环嗜中性粒细胞计数,NLR,和等离子MPO含量与中风严重性相关但不总活跃MMP-9血浆浓度;(2)中性粒细胞数量与高血浆MMP-9浓度在整个队列,即使调整延迟样本收集和中风的严重程度;(3)较高的中性粒细胞数量与等离子体MPO含量在所有患者;(4)嗜中性粒细胞计数和NLR更高资格的病人静脉rtPA治疗而不是总活跃MMP-9等离子体和MPO浓度;(5)较高的中性粒细胞计数和NLR独立与贫穷相关结果和更高的死亡率为3个月,但不与西奇;(6)MPO等离子体浓度与贫穷有关的结果,但不是西奇和死亡率;和(7)总活跃MMP-9等离子体浓度并不与任何3点结束。
为了更好地理解如果MMP-9和MPO可以视为中性粒细胞的介质效应,5然后我们的研究集中在neutrophil-derived MMP-9和MPO。我们发现:(1)在H0 MPO等离子体浓度后体外rtPA刺激患者更高资格IV rtPA治疗但不与HT有关,但是没有发现差异有关neutrophil-derived MPO IV rtPA浓度在治疗的患者;(2)H72后,循环从患者中性粒细胞IV rtPA释放更多MMP-9,但不是MPO,从病人刺激比后不及时治疗;(3)在整个群体中,只有neutrophil-derived MPO含量被认为是负相关与neutrophil-derived MMP-9 H0;和(4)MPO等离子体浓度被发现与NLR H72。
因为MMP-9或独自TIMP-1的抗原水平可能并不总是反映MMP-9的潜在活动,总活跃MMP-9活动测量。我们的研究是第一个评估等离子MMP-9的活性形式之间的相关性和neutrophil-derived MMP-9水平和中性粒细胞在急性脑缺血患者在症状出现后的第一个小时。
之间的主要限制是几个小时的延迟发病症状和样品收集在Biostroke研究中,有可能选择偏见由于需要书面知情同意。当调整延误的分析样本收集关于MMP-9,结果依然相似,但这可能不足以完全正确的延迟,如果不是完全线性的关系。因此,它是可能的峰值MMP-9可能已经错过了在我们的研究为nonstatistical意义的结果。鉴于文化中性粒细胞的相对较短的寿命,推迟隔绝后的血液是一个实际的困难限制了数量的病人在研究小组招募了中性粒细胞脱粒。另一个限制是缺乏数据预行程的功能状态,这样我们就可以不执行预行程夫人之间的转变分析,在3个月。
2以前的研究,但不是我们的,更高的等离子体在患者都MMP-9浓度有关13和IV rtPA未经处理的,29日有更糟糕的结果,29日尤其是西奇。13可能解释这种差异可能是样本集合的延迟,即小于329日或者4.5小时13vs 48小时在我们的研究中:MMP-9浓度增加在第一症状出现后2 - 6小时,5,30.然后在卒中后48小时内保持稳定,7确认在我们的小组。然而,它也被报道,无论是基线MMP-9浓度测量的几个小时内发病也MMP-9在14天内任意点的速度有任何与HT的风险患者rtPA剂量较低的。31日另一个可能的解释可能躺在HT的使用不同的定义,也就是说,每一个HT13而不是西奇在我们的研究中。
我们的研究表明一个rtPA对中性粒细胞脱颗粒的影响根据动力学和分布格局的三级(MMP-9)和初级颗粒(MPO)。这是一致的证据表明rtPA扮演了一个角色在中性粒细胞脱粒和MMP-9释放,见一些体外实验。7,22
之间不存在相关性血浆MMP-9浓度和中风的严重程度在整个Biostroke研究包括在48小时内。这一发现可能与短半衰期(即。,1- - - - - -2hours) of rtPA, so that rtPA could influence the MMP-9 upregulation more in the first hours following its administration.29日我们不能排除的样本量太小rtPA在患者亚组分析。然而,更糟糕的结果统计与更高的中性粒细胞计数和NLR在同一样本,正如前面所描述的我们。4
的细胞来源MMP-9是有争议的。32如果我们考虑整个人群中,血浆MMP-9浓度与中性粒细胞计数和NLR相关。这一发现与我们的体外实验的结果与假设一致的是,循环中性粒细胞代表MMP-9流通的主要细胞来源。33然而,缺乏等离子MMP-9浓度之间的相关性和在我们的研究结果可以解释的存在其他细胞来源的脑缺血急性期以及居民脑细胞,血管细胞或其他循环免疫细胞。33我们的结果的另一个可能的解释是用来测量MMP-9方法。与其他研究不同,选择是定做的潜在活动总活跃MMP-9,负责组织损伤。
MPO等离子体浓度与中风的严重程度有关,同意早期的研究。18,34MPO等离子体水平升高中风患者与正常对照组相比18并且可以预测未来中风和vasculopathic事件Fabry疾病。35在我们的研究中,MPO等离子体浓度与中性粒细胞计数相关。MPO中最丰富的组件azurophilic(或主要)中性粒细胞的颗粒,这是最后一个被脱粒从中性粒细胞释放出来。16事实上,在我们的研究中,之间的负相关neutrophil-derived MMP-9和MPO承认可能是由于中性粒细胞的激活动力学响应rtPA。6事实上,MPO活性高峰之后,卒中后3 - 7天左右。17,19传统上一直使用它作为中性粒细胞病理标记。的确,现在承认MPO不是独家中性粒细胞的标志,但它也表达了骨髓,尤其是单核细胞和巨噬细胞和小胶质细胞。36
我们的研究揭示了统计中性粒细胞计数和NLR之间的联系和MPO等离子体浓度,但不是MMP-9,与中风的结果。这可能表明MMP-9可能不是一个有趣的中介的中性粒细胞产生任何有害的影响中风的严重程度和结果。更高的MPO等离子体浓度与功能结果更糟,但不是西奇和死亡率。这个观察符合一项研究显示,MPO的角色在预测中风严重性。18,37虽然我们的研究表明一个协会,但是不是中性粒细胞和MPO之间的因果关系,我们可以推断MPO可能在将来的研究中一个潜在的治疗目标。
关于post-thrombolysis出血,MMP-9的选择性抑制作用33,38承诺和MPO可能低于全球抑制中性粒细胞改善脑缺血患者预后。39其他潜在的介质,如弹性蛋白酶、活性氧物种,和其他基质金属蛋白酶,37需要评估。5中性粒细胞是post-thrombolysis出血的关键因素。4,39嗜中性粒细胞释放的所有的因素、MMP-9和MPO似乎没有足够的,虽然它仍是确定他们的位置除了或发布的协同与其他因素。37,40
研究资金
这项研究是由该项目医院矫揉造作的倩碧(Biostroke、方向兴业银行de la桑特2006/0153)。
信息披露
Maestrini, m . Tagzirt s Gautier a .杜邦点Mendyk, s . Susen a . Tailleux大肠Vallez, b . Staels报告没有披露。c . Cordonnier报告收到勃林格殷格翰集团发言人费和辉瑞公司是临床试验的研究者Astra-Zeneca,勃林格殷格翰的发言,Daichi-Sankyo, Servier,是百时美施贵宝顾问委员会的成员。d .草地的报道赠款的Health-Grant PHRC期间进行的研究;接受资助的研究从医院和Adrinord补偿参与顾问委员会和座谈会的BMS /辉瑞,勃林格殷格翰集团、拜耳、外提交工作;》杂志的欧洲卒中杂志。r·朱尔茨博尔代报告赠款的Health-Grant PHRC期间进行的研究。去首页Neurology.org/N为充分披露。
承认
作者感谢里尔中心德资源以及技术援助和贡献;瓦伦提娜帕内塔和逻辑回归模型的统计修正。
附录的作者
脚注
去首页Neurology.org/N为充分披露。资金信息和披露认为作者相关的,如果有的话,年底提供这篇文章。
↵*这些作者的贡献同样这项工作。
零假设的这篇文章发表的协作努力,神经学和CBMRT之间。首页
- 收到了2019年2月19日。
- 接受的最终形式2019年12月10日。
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